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牛血清醋酸纤维素薄膜电泳 目的要求 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理及操作过程。 了解牛血清蛋白质的各种成分。 熟悉牛血清中各种蛋白质相对含量的测定原理和方法。 熟悉分光光度计的工作原理及使用方法。 实验原理 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。电泳过程必须在一种支持介质中进行。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。蛋白质是由氨基酸组成的，其分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。 凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---比耳定律。 染色液：称取氨基黑10B 0.5克，加入蒸馏水40毫升、甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混匀，保存备用。 漂洗液：量取95%乙醇45毫升，冰醋酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，保存备用。 NaOH溶液（0.4N）：称取NaOH 16克，用少量蒸馏水溶解后定容至1000毫升。 实验步骤 1.浸泡醋酸纤维素薄膜 选择质匀、孔细的醋酸纤维薄膜，在无光泽面的一端1.5 cm 处，用铅笔轻画一横线作为加样线并编号，然后置于装有pH8.6的巴比妥缓冲液中，并使之完全浸没，选取在15~30秒内迅速润湿且表面无斑点的醋酸纤维素薄膜，浸泡约15分钟。 2.点样 用镊子从缓冲液中取出醋酸纤维薄膜置洁净的滤纸上吸去多余的水分，使醋酸纤维薄膜既保持湿润状态又无明显的水分，注意不能吸得太干，以免影响导电，导致电泳图谱有条痕，亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来，导致电泳图谱分离不齐。 将醋酸纤维薄膜置于洁净的滤纸上，无光泽面向上。将血清均匀涂抹于点样器上，然后垂直印在点样线上，停留2-3秒待血清完全渗入后移开，形成一条粗细宽窄一致的血清线。注意点样时不能太过用力。 电泳 将点样好的薄膜用镊子迅速平贴在电泳槽的滤纸桥上，并使点样端贴在阴极上，无光泽面向下。为了使膜条与电场平行,还应把膜条与电极之间压严（不能有气泡），使膜条绷直，中间不下垂。放好后盖好电泳槽盖，平衡10分钟后通电，电压可选择95V左右，电泳50min左右。后关闭电源。在电泳过程中注意观察电流的变化。 4.染色与漂洗 将电泳好的薄膜取出，放入染色液中浸泡约5分钟。染色过程中可以轻轻抖动培养皿以使染色更加充分、均匀。注意不要让薄膜重叠。 染色完毕后，用镊子取出薄膜并立即浸泡于漂洗液中，更换漂洗液，漂洗2~3次，背景完全漂洗净后用滤纸吸干薄膜。漂洗过程中可用镊子夹住薄膜轻轻抖动。漂洗完毕后可看到五条清晰的蛋白质带。 5.洗脱法测定各种蛋白质的相对含量（选做） 挑选所得薄膜中蛋白质区带分离最清晰的薄膜，用剪刀小心剪开五条蛋白质带，另于点样线以下剪一大小与色带相仿的薄膜作为空白对照组。取六支试管，编号。将所得的蛋白质带和无色薄膜分别放入六支试管中，用吸量管吸取4mL 0.4mol/L的NaOH溶液分别加入到每支试管中。在室温中放置30分钟，并不时振荡，直至薄膜带上的蓝色全部脱下。选择波长650nm进行比色。以空白对照组调零，分别读出各个蛋白组分的吸光度。 吸光度总和 T=O.D清蛋白（A）+O.Dα1+O.Dα2+ O.Dβ+O.Dγ 各组分蛋白质的百分数为：清蛋白A= O.D清蛋白（A）/T×100%