以海藻酸三维支架构建BMSC源性生物人工肝组织实验研究.pdfVIP

第十三届全国普通外科学术会议论文汇编 以海藻酸三维支架构建BMSC源性生物人工肝组织的实验研究 广州中山大学附属第三医院肝胆外科510630 林继宗 汤照峰方和平林楠胡昆鹏许瑞云 天津南开大学生物活性材料教育部重点实验室300071杨军 中山大学干细胞与组织工程研究中心510080项鹏 通信作者：许瑞云E—mail：xuruiyun@yahoo．corn．ca 以骨髓间质干细胞(bone stem 【摘要】目的 cell，BMSC)为种子细胞，以海藻酸三维支 mesenchymal 架为载体，研究两者的相容性及其构建生物人工肝组织的可能性。方法将大鼠BMSC接种于海藻酸三维支 架上，采用倒置相差显微镜、扫描电镜分别检测BMsC的黏附、生长与增殖情况，评价两者的相容性：同时 向肝细胞分化，检测培养液内尿素氮和白蛋白含量的变化，RT—PCR检测培养细胞ALB和AFP基因的表达， 糖原染色及免疫荧光法检测细胞糖原合成功能和CK．18的表达。结果大鼠BMSC在海藻酸三维支架上能正 常地黏附、生长和增殖；于海藻酸三维支架内加入诱导液作用于BMSC后，培养液内尿素和ALB的含量逐 为诱导因子，能在海藻酸三维支架上成功诱导BMSC向肝细胞分化；海藻酸三维支架和BMSC可望成为肝脏 组织工程理想的种子细胞和细胞载体。 肝组织工程的研究主要包括三个层面：理想的种子细胞研究：具有优良生物相容性的肝组织工程支架 材料(即种子细胞载体)的研究；诱使种子细胞向肝细胞生长与分化的诱导方法与细胞因子的研刭¨。骨髓 间质干细胞(bone stem mesenchymal 向分化潜能，在体内和体外均能被诱导分化为肝细胞口圳，使其可能成为肝组织工程的理想种子细胞。肝组织 工程支架材料的研究目前还处于幼稚阶段，尚未筛选出理想的细胞载体，而取自天然材料的海藻酸支架具有 良好的亲水特性，疏松多孔的立体结构和优越的组织相容性已经被作为细胞载体在组织工程研究包括肝组 诱导因子，进行了构建BMSC源性生物人工肝组织的实验研究，旨在为研发实用化的生物人工肝奠定基础。 材料与方法 一、材料SD大鼠，60～809左右 二、方法 (一)BMSC的分离、培养及扩增 将SD大鼠断颈处死，无菌条件下取出股骨及胫骨，用含10％胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔， 细胞备用。 (二)海藻酸三维支架的制备 la Q一2MEM稀释，终浓度为3％。吸取3％的海藻酸水溶液700l滴入12孔塑料培养板的孔中，在孔内形成约lmm 厚度的圆盘，再滴入0．1％的CACl22rnl于圆盘上，静置40min。待凝胶形成后弃去CaCl2，改用2mlQ一2MEM浸泡， 放／N．4*C冰箱，每24h更换Q一2MEM--次，72h后用于细胞培养。 (三)BMSC与海藻酸三维支架相容性的检测 第十三届全国普通外科学术会议论文汇编 X la 106细胞的BMSC悬液约200l滴注于支架 将海藻酸三维立体支架放置于24；fL板内，共8孔。将含有1 上并放置于培养箱内，3h后加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液常规培养，定期于倒置相差显微镜下观 察BMSC在支架上的黏附及增殖情况。细胞与支架复合物共同培养7天后于冰冻干燥箱内干燥24h，表面喷金 后于Philps扫描电镜下观察。 (四)诱导分化及功能检测 1．诱导液的配置及诱导方法：诱导液配方如下：60％DMEM，40％MCDB．201，1 mg／ml牛血清蛋白 (BSA)，10—8M地塞米松，10-4M维生素C，2％胎牛血清，10 FGF-4。将