“肝心宁”对肝纤维化大鼠PDGF-BB表达和病理积分影响的实验研究.pdfVIP

“肝心宁对肝纤维化大鼠PDGF．BB表达 及病理积分影响的实验研究 李生财甘肃省中医院消化内科(730050) 肝纤维化是炎症刺激或肝细胞发生坏死时，肝内纤维组织异常增生的病理过程，是各种慢性肝 病发展为肝硬化的必经阶段，肝纤维化一旦发展到肝硬化阶段则很难阻断或逆转其病理过程进一步 发展。近年来的研究表明，肝纤维化的病理是可逆的。因此，延缓阻断乃至逆转肝纤维化的病变过 程，对防治肝硬化有着非同寻常的意义。近年来，中医药学界的专家学者们在抗肝纤维化领域进行 了大量临床和实验研究，并且取得了系列卓有成效的成果。成都中医药大学研创的“肝心宁”胶囊 就是其中之一。本研究通过观察“肝心宁”对肝纤维化大鼠肝组织学改变和PDGF-BB表达的影响， 旨在寻找“肝心宁”防治肝纤维化的客观证据，为进一步研发打下基础。 1实验材料 1．1 实验动物 证号：川实动管第lO号。 1．2药物试剂 “肝心宁”混悬液：“肝心宁”胶囊为成都中医药大学附属医院院内制剂，用蒸馏水配制成生药 浓度为0．659／ml和2．69／rnl的“肝心宁”混悬液，分别作为中药低剂量、中药高剂量组实验用药。秋 水仙碱：由云南植物药业有限公司生产，用蒸馏水配制成浓度为1．25mg／ml的混悬液备用。CCL4- 由天津市美琳工贸有限公司生产，将高纯度四氯化碳和提纯花生油按容积比4-6混匀，配制成40％ 的四氯化碳花生油溶液备用。高粱酒：60度原度高粱酒，四川邛崃高粱酒厂生产。PDGF-BB一抗 试剂、二抗试剂：均由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1．3实验器材 DP70型显微摄像系统、全能台式冷冻离心机、HM315型组织切片机、W-O系列恒温水浴锅、 CSl01．A型电热鼓风干燥箱、E22E．3型微波炉、微量移液器。 2实验方法 2．1分组造模 52只SD大鼠遵从随机、均衡原则，采用查阅随机数字表法将其分为空白组、模型组、阳性对 照组、中药低剂量组、中药高剂量5组。其中空白组8只，其余各组11只。除空白组外，其余各组 参照文献采用改良复合因素法复制大鼠肝纤维化模型。具体方法：60度的原度高粱酒灌胃 量，大鼠背部皮下注射，以后每隔3天，按0．3ml／1009的剂量大鼠背部皮下注射，共计6周)；在整 个实验过程中，以用高脂低蛋白饲料(以玉米面为饲料，加0．5％胆固醇，20％猪油)喂养大鼠，自 由供饮自来水。 2．2给药方法 造模前l天开始给药，空白组与模型组以生理盐水10ml／kg灌胃，对照组以秋水仙碱悬液 前4周隔日给药一次，后2周每日一次，至造模同期结束 ．．．一495．．．．． 2．3检测方法 2．3．1病理形态学观察 HE染色观察肝组织病理形态变化：造模给药同期结束后第2天处死大鼠，剖腹分离肝脏，切取 肝左叶组织一块，在10％福尔马林中固定一周，再经过脱水、浸蜡、包埋等处理，切片，常规HE 染色。各张组织切片用生物显微镜进行观察，并用显微摄像系统在低倍镜、高倍镜下选取清晰视野 拍照。参照文献提供的标准对各切片大鼠肝组织的炎症活动度、纤维化程度进行分级分期，并按照 半定量标准，对炎症活动度、纤维化程度进行量化评分。同一切片不同视野病变程度存在差异时， 以病变程度较高视野为准进行评定。 2．3．2 PDGF．BB表达程度的观察 免疫组化法观察肝组织PDGF-BB的表达程度：石蜡切片常规脱蜡和水化；PBS漂洗；抗原修 箱中半小时；PBS漂洗：滴加试剂SABC；PBS漂洗；加DBA显色剂：蒸馏水漂洗；脱水、封片。 阴性对照，以PBS代替一抗。各张组织切片在低倍镜、高倍镜下选取清晰视野拍照。利用Image．Pro Plus 6．0图象分析系统对各张照片进行处理，观察棕色阳性反应点在组织中表达的位置。每张切片随 机选取5个视野，测定阳性物质所占面积的平均积分光密度(DP)，该数值越大表明组织中该抗原 含量越高。 2．3．3统计方法 各组数据以均数±标准差(i盎)表示，用SPSSl3．0统计软件进行采用单因素方差分析，t检 验。 3结果 3．1一般状况 每天观察观察大鼠的毛色、精神、行为、饮水量、摄食量、体重等。除空白组外，其余各组大 鼠在造模过程中均出现精神萎靡、活动减少、皮毛皱而不