N(as)实时荧光定量PCR4.pptVIP

用SYBR Green I进行GMO定量 转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。 目前为止，已有包括欧盟国家在内的40余个国家、地区要求对转基因生物及其产品进行标识管理 食物种转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990) ，规定0.9%阈值标准（2003) 用SYBR Green I进行GMO定量 转基因生物包括了转基因载体的核酸序列，包括调控序列，抗性基因序列 食物中不同程度的混有转基因成分 通过内标基因（转基因与非转基因植物都等量表达）来对每个样品DNA进行定量 定量外源基因（只有转基因植物表达）的比例来进行GMO含量检测 基本步骤 设立标准品： GMO生物与对应的非GMO生物按不同比例混合，提取DNA 选择目标基因(A)与内标基因(B)，分别扩增得到不同混合比例下的C(t)值 公式推导 %GMO=A/B log2 (%GMO)=log2 (A/B)=log2 A-log2 B=ΔC(t)*N 以log2 (%GMO)与ΔC(t)作标准曲线 待测样品的ΔC(t)值通过标准曲线求得log2(%GMO) 实验过程 材料 Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非转基因大豆 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品：大豆饼,豆制甜点和两个牌子的面粉 标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 转基因大豆 实验样本–从含大豆成分的样本中提取DNA 反应的建立 目标基因：EPSPS 内标基因：Lectin 保证扩增效率一致 实验结果 SYBR Green I绝对定量方法确定转基因拷贝数 转基因植物中转基因拷贝数的确定是研究其分子特性的基础步骤之一 传统的Southern方法准确性高特异性好，但是费时费力，需要大量的DNA 实时荧光定量PCR技术，利用野生植物的基因组DNA与包含转基因的质粒按不同比例混合，模拟不同拷贝数的转基因植物基因组DNA，通过PCR得到C(t)与拷贝数的标准曲线。同时未知拷贝数的转基因植物使用等量的基因组DNA进行PCR，以C(t)值从标准曲线中获得实际的拷贝数 研究mudrA转基因玉米中拷贝数 无转基因玉米基因组DNA 20ng+mudrA质粒 1200~1.2╳106模拟不同拷贝数的转基因植物基因组DNA 10个未知样品基因组DNA 20ng 设计引物，建立实时荧光PCR反应。同时扩增标准品和样品。 实验结果 未知样品C(t)值 标准曲线 实验结果 拷贝数 小结 TaqMan探针，双标准曲线法，在肿瘤相关基因表达差异的检测 TaqMan探针，在基因型分析中的应用 SYBR Green I，在食品%GMO的检测中的应用 SYBR Green I，在绝对定量转基因拷贝数中的应用 * DNA from Standard/Sample PCR mix GMO primers TUBE 1 TUBE 2 PCR mix Lectin primers 熔解曲线 – Lectin 扩增 熔解曲线 – EPSPS 扩增 Tm = ~92oC Tm = ~88.5oC 0.7 23.4 24.2 Soy Burger ND 22.2 ND Soy Flour 2.1 22.4 24.6 Soy Dessert 1.9 22.7 24.6 5.0 3.4 22.8 26.2 2.0 4.7 22.5 27.2 1.0 5.6 22.5 28.2 0.5 ND 22.6 ND 0.1 ND 22.6 ND 0 ?C(t) C(t) Lectin C(t) epsps Standards/ Sample y = -0.264x + 1.202 R 2 = 0.998 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 0 1 2 3 4 5 6 ? C(t) Log percent GMO 5 0.7 Soy Burger 0.5 ND Soy Flour 4.40 2.1 Soy Dessert %GMO ?C(t) Standards/ Sample 30.69 34.63 31.85 35.60 31.28 33.72 31.60 33.51 33.10 31.22 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 21±2 3±1 11±2 2±1 15±1 5±1 13±2 5±1 6±1 16±1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 *