蛋白质相互作用的研究方法_百替生物.pdfVIP

蛋白质相互作用的研究方法 姓名：王连连 导师：梁建生 专业：植物学 举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组 DNA 序列尚不能解答许多生命问 题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主 要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础[1]。细 胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个 过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控,介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与 其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质 单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研 究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋 白质组学研究中的热点。 1 生物物理学方法 1.1 融合蛋白 pull-down 实验 融合蛋白 pull-down 技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上 (如 Sepharose),当细胞抽提液 经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用 pull-down 技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白 与 一 种 易 于 纯 化 地 配 体 蛋 白 相 融 合 。 1988 年 Smith 等 利 用 谷 胱 甘 肽 － S － 转 移 酶 （glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出 GST 融合蛋白。从此 GST 融合蛋白在 蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST 融合蛋白在经过固定有 GST(glutathione)的色谱柱 时，就可以通过GST 与 GSH 的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋 白相互作用的兴趣蛋白[2]。一般来说，GST 融合蛋白 pull-down 方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融 合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。该方法比较简便，避免 了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球 菌蛋白 A 融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有 IgG 的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵” 蛋白可以通过结合 Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋 呤的色谱柱进行纯化等等。 1.2 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与 标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱 饵”蛋白等。 1.3 免疫共沉淀 如果在非变性的条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持，所以就可利用免疫共沉淀方法 service@100 [3] 找出相互作用的蛋白质。这其中的例子包括Harlow等 。利用抗体沉淀腺病毒的EIA蛋白时发现了真核细 胞中有与EIA蛋白特异结合的蛋白质；McMahon等[4]利用该方法确定了转录结构域相关蛋白质可以与E2F1和 c-Myc转录因子相互作用的蛋白质。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也 可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中 的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用SDS鉴定.免 疫共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高.设置的对照包括：在对照 组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 1.4 荧光共振能量转移技术 荧光共振能量转移技术的原理是：处于激活状态的供体，可以将其本身的荧光传递到与之十分邻近（通 常在 10nm 之