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细胞杂交建立HBV感染模型 董肖萌 赛林涛 王 刚 陈丰哲 曲春媚 郑峰 邢全台 马立宪 山东大学齐鲁医院感染性疾病科 250012 摘要 本研究结果证实，我们建立的杂交细胞株HepCHLine-4兼具有HepG2和人原代肝细胞 的遗传特性。它一方面继承了人原代肝细胞对HBV的易感性，另一方面，继承了HepG2细 胞能在体外无限传代的特性，克服了人原代肝细胞作为HBV感染细胞模型的缺陷。 HepCHLine-4对HBV自然感染易感，并能在感染后启动有效的病毒复制，合成HBV特异性 抗原并能合成子代病毒颗粒分泌出细胞。因此，杂交细胞株HepCHLine-4可以作为适宜 于HBV自然感染的细胞模型，进行HBV感染宿主细胞的早期机制，包括病毒黏附、穿入、 脱壳等早期感染过程的研究和病毒侵入人肝细胞后完整的复制过程的研究，对于研究阻 止HBV感染的药物开发具有重要的临床意义。 [关键词]HBV;细胞模型；杂交细胞；感染；复制 究。本研究旨在建立一个适合于HBV自然感染，并能有效进行病毒复制的细胞模型，为 HBV感染宿主细胞的早期机制，以及病毒侵入人肝细胞后完整的复制过程的研究提供一 个有用的研究工具。 人原代肝细胞具有HBV高亲和性，但不能体外长期传代；而HepG2细胞可以体外长期 传代，但对HBV不易感。如果将两者通过细胞杂交技术，使其各自的遗传信息结合起来， 筛选出既能对HBV易感又能体外传代的杂交细胞，将对于揭示HBV吸附、穿入和脱壳和研 究阻止HBV感染的药物开发具有重要的临床意义。 具体实验内容如下： 一．杂交细胞株的建立 【目的】 建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞，以作为后续实验研究的基础。 【方法】 1 建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞。 1．1 利用化学诱变剂诱导HepG2细胞产生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)基因突变。 1．2 人原代肝细胞的分离与培养，台盼兰染色排除法确定肝细胞存活率。 1～ 与人原代肝细胞进行融合，经HAT培养基筛选出异核体杂交细胞，进而用有限稀释法进 行单克隆。 1．4 利用胰蛋白酶G最带技术对所得细胞进行核型分析。 1．5 绘制杂交细胞生长曲线。 2对杂交细胞是否携带HBV基因进行检测。 2．1 合成HBV型特异性引物，用巢式PCR检测杂交细胞内及培养上清中是否存在 HBVDNA。 2．2 提取杂交细胞基因组DNA，绿豆核酸酶消化后，巢式PCR检测杂交细胞内是否 cccDNA。． 存在HBV的复制中间产物HBV 2．3 杂交细胞是否表达HBV特异性蛋白抗原：间接免疫荧光检测杂交细胞内是否 有HBcAg的表达；电化学发光法检测杂交细胞培养上清中的HBshg和HBehg。 【结果】 l 成功建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞。 1．1 基中生长，说明HGPRT—HepG2细胞中次黄嘌呤核苷酸焦磷酸化酶(IPP)完全缺失。 1．2 人原代肝细胞经台盼兰染色排除法确定存活率--90％。 1 18 1．3 生长。 1．4 细胞和人原代肝细胞的基囚，兼有这两种细胞的遗传特性。 1．5·绘制杂交细胞生长曲线，结果显示HepCHLine一4杂交细胞符合传代细胞生长 过程特点。 2杂交细胞自身不携带HBV基因。 2．1 DNA。 杂交细胞内及培养上清中均未检测到HBV 2．2 cccDNA。 杂交细胞内不存在HBV的复制中间产物ItBV 2．3 杂交细胞不能表达HBV特异性蛋白抗原：杂交细胞内没有检测到I-[BcAg的表 达；杂交细胞培养上清中也没有检测到HBsAg和HBeAg。 【结论】 。 1．成功建立了一个兼具有HepG2和人原代肝细胞遗传特性的杂交细胞株 HepCHLine-4，可以进一步用来研究建立适宜于HBV感染的细胞模型。 是并不携带HBV基因及HBV的复制中间产物，故可以用于HBV感染的实验研究。 ne-4X寸嗍自然感染能力 =．评价杂交细胞卜bp