不同型Gsα缺失体在大肠杆菌中的克隆和表达.pdfVIP

242 中国癌症研究进展⑤ 不同型Gs伍缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达 楼金星黄君健司艺玲李杰之赵亚力叶祺浓黄翠芬 Gs a是研究最多、与临床关系最密切的一种G蛋白，其主要功能是将受体接受的信号转 导给腺苷酸环化酶(AC)，使AC激活。同时也可直接作用于离子通道而发挥作用。Gsa基因 发生突变或转录产物发生异常剪接会导致疾病…。在人类肿瘤中已经发现存在Gsn基因突 变拉oJ。我们在自血病细胞株的研究中发现了Gs口基因的3个缺失突变体以及野生型的Gs a(分别命名为GsaL-1，500 bp；GsnL-3，200 200 bp；GsaL-2，300 bp和Gsp4，1bp)，并在一 200 m 些急性白血病患者中检测到L5,6J。序列分析表明，1bp即是野生型的Gsa(命名为G8 4)，而另外3种Gsa均为不改变阅读框架的不同缺失体。其中GsaL-1缺失正常Gsn的第 23--249个氨基酸和第254 基酸之间的区域，GsaL-3缺失了第6～329个氨基酸之间的区域。这3个缺失体片段分别编 码160、90和70个氨基酸，它们的共同特点是均缺失了正常Gsa的GTP酶活性部位。我们 采用DNA重组技术，将这3种Gs a缺失体基因在大肠杆菌中进行了克隆、表达，以便了解这3 种异常缺失体的表达特征，深入研究其生物学功能。 材料与方法 (一)材料 1．质粒和茸椿含有3种Gs a a a-4) a的质粒(pucl8．GsI．-1、pUCl8。Gs L-2、pUCl8．Gs DH5 q、BL21 由叶棋浓博士构建，原核表达载体pET22b(+)为Navagen公司产品；E．co／i (D岛)和XL-BIue菌株均为本室保存。 2．酶及其他试荆 限制性内切酶及工具酶均购自隼美生物工程公司；蛋白质分子量标准 Purification 赡于原平生物公司；DNARapid Kit为博大科技公司产品；其他化学试剂均为国产 分析纯试剂。 f二)方法 ， 1，DNA操作DNA的酶切、回收、连接，质粒的转化与抽提，琼脂糖凝胶电泳等均按文献 [7]提供的方法进行。 引物中分别引人NeoI和XhoI位点，即： 5’引物序列Cr(￡A|rc8GI珂oC【xEGGGAAC； 3’弓I物月；列ACCTCGAGCAGCl℃mAClGACG。 作者单位：100700北京军区总医院血液科(搂金星)；军事医学科学院生物工程研究所(黄君健李杰之 叶棋浓黄翠芬)；河南医科大学微生物与免疫学教研室(司艺玲)；解放军总医院分子生物学研究所(赵亚力) 不同型Qa缺失体在大脑杆菌中的克隆与表达 243 a a 以质粒(pUCl8．GsL-1、pUCl8一Gs roan。PCR产 95℃4min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共进行25个循环，最后72℃延伸7