酶法生产海藻糖中酶反应条件研究.pdfVIP

酶法生产海藻糖中酶反应条件的研究 周延 表其朋 孙长慧 北‘京化工大学化学工程学院制药工程系，北京 100029) 摘要 该丈通过对自筛出的一株徽球菌 (Micmccusroseus)进行海藻特合成吟的释放处理条件和海藻 掩合成的醉反应条件的研究，建立了使用粗醉不经纯化，直接进行酶反应的工艺流程;得到了从醉的 释放g.阵反应的一系列优化条件:20%细胞悬液，25℃下用3%甲苯处理2hr,然后在loo.M缓冲液 中，pH9.0,45℃下与淀粉液化液进行踌反应。徉到海藻特含童IImg/ml，转化率达44%。在此基础 上，进一步进行了淀粉浓度的实脸，以30%,DE为 10%的淀粉液化液进行反应，海藻糖含蚤达 8o.g/ml,转化率达53% 关，词 海藻祷 阵法合成 淀粉 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩经基缩合而成，广泛分布于海藻、酵母、霉菌、昆虫、 高等植物体内，不但能保护生物细胞和生物活动性物质在恶劣环境下活性免遭破坏1.1;而且在强 辐射条件下，可以保护细胞中DNA分子免受损害，21，并且这种保护是非特异性的。因此，海藻 搪在医药、食品、农业、化妆品等方面具有广阔的应用前景，是国际上近年来开发的主要低聚 糖之一131。 早期，海藻糖的生产主要是从酵母中提取，成本很高，限制了海藻糖应用的发展。以淀粉 为原料酶法生产海藻糖为海藻糖[41151生产开辟了一条新的途径，使其生产成本从200USD/纯降至 3USD/吨，也为海藻糖的大规模工业化生产提供了可能性，同时廉价的海藻糖的产生也将会极大 推动相关产业的发展。 国内对酶法合成海藻糖的研究才刚刚开始，而且主要集中在菌种筛选和代谢研究方面，对 合成海藻糖的酶反应几乎没有深人的研究。本研究室自2000来，进行了产海藻糖合成酶的菌种 筛选，并对自筛出的一株微球菌 (Micmccusroseus)进行海藻糖合成酶的释放处理条件和海藻糖 合成的酶反应条件较系统的研究，建立了使用粗酶不经纯化，直接进行酶反应的工艺流程;得 到了从酶的释放到粗酶反应的一系列优化条件。 1 材料与方法 1.1 主要试别 海藻搪为sigma产品;a淀粉酶为无锡酶制剂厂生产;HPLC分析用试剂为色谱纯;其它试剂 均为分析纯试剂。 1.2 分析方法 1.2.1海藻糖的分析方法一HPLC法[a1 岛津LA-10vpHPLC,ZORBAX-NH2柱 (150cm)，柱温20t,流动相:乙睛一水 (80: 20)，流速1ml/min;示差折光检测器。 1.2.2 还原糖的分析方法 DNS法。 .13 实验方法 1.3.1菌种培养 川 菌种 本实验室自筛菌种。 (2)培养基 a斜面培养基 (以L):可溶性淀粉 20，蛋白膝 10，牛肉膏 5,Nacl5,pH自然。 b摇瓶培养基 (创L):葡萄糖 20,酵母粉 20，蛋白陈 5,K2HP04 1,MgS04.7H20 328 。.5，pH自然 (经优化，将另具文发表)。 (3)发酵培养 先将细菌由斜面培养基接种于种子摇瓶培养基，300C,140rpm，培养18hr。以5%的接种量 接人发酵培养基，30cC,140rpm,72hra 1.3.2海藻搪合成酶的释放 将土述发酵液以100001P.离心5min,菌体以20%浓度悬浮于一定离子强度的磷酸缓冲液中， 以一定浓度的甲苯处理一段时间，以释放海藻糖合成酶。 1.3.3 海藻糖的酶法合成反应 在带塞三角瓶中，将上述经细胞破碎的酶液 101111与Mn]5%的液化淀粉液混合，于一定温 度下，振荡反应一段时间。取出，沸水浴l0min杀酶，离心测样。 1.4 实脸内客 .14.1在酶的释放过程中，考察甲苯的加人量、破碎温度和破碎时间对合成海藻糖的影响情况。 1.4.2考察pH,温度、离子强度、反应时间对海藻糖合成反应的影响。 1.4.3 考察不同淀粉浓度及淀粉液化度对海藻糖合成反应的影响。 2 结果与讨论 2.1 菌种 本实验室自筛的菌种，经鉴定为一微球菌 (Micloccusroscus)，据报道其所产海藻糖合成相关 酶为麦芽低聚海藻糖合成酶 (M75ase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (MTHase)。两者均为胞内 酶，其合成海藻糖的酶反应式为: 麦芽低聚糖