鸡血细胞的体外融合.pptVIP

鸡血细胞的体外融合 动物细胞融合是细胞工程技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。 实验目的 了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。 实验原理 细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。 实验原理 实验原理 依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为： 病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）； 化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）； 电场诱导的细胞融合； 激光诱导的细胞融合 实验原理 PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。 商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。 实验原理 实验仪器、用具 注射器 滴管 烧杯 容量瓶 凹面载玻片 盖玻片 离心机 水浴锅 显微镜 细胞计数板 酒精灯 刻度离心管 试剂 Hanks原液（10×） NaCl2 80.0g Na2HPO4·12H2O 1.2g KCl 4.0g KH2PO4 0.6g MgSO4·7H2O 2.0g 葡萄糖 10.0g CaCl2 1.4g 试剂 Hanks原液（10×） 称取1.4gCaCl2，溶于30~50ml蒸馏水中 取1000mL的烧杯及容量瓶各1个，先放重蒸水800mL于烧杯中，然后按上页表顺序逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000mL 试剂 Hanks液 Hanks原液 100mL 重蒸水 896mL 0.5%酚红 4mL 配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。 试剂 0.85% NaCl溶液 GKN液 50%（m/V）PEG溶液 取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min 让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固 加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。 詹纳斯绿染液 方法与步骤 鸡血细胞储备液的制备 取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍体积0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃。 鸡血细胞的处理 取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1500rpm离心5min，弃上清，用5mL 0.85 %NaCl溶液重悬浮沉淀，重复离心操作1次。 方法与步骤 鸡血细胞悬液的制备 在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。取0.5ml鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。镜检，在血细胞计数板上计数。稀释至1X107个/ml，于37℃保温。 方法与步骤 鸡血细胞的收集 吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 方法与步骤 PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。 方法与步骤 终止PEG作用 缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。 制备细胞悬液 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。 方法与步骤 染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情