灰褐裢霉菌（S.griscofuscus++S1001）碱性几丁质酶的纯化和酶学性质研究.pdfVIP

第二届全国发酵工拦学术¨i；电去论文集 iS08 几丁质酶的纯化及酶学性质研究‘ 陈亚戍¨ 王石磊 王明道 贾新成 (河南农业大学生物工程学院郑州450002) 岛阿堍。I．0．T1呻∞卯0．005．N屯Oq11．0(单致灭■)的培井墓中．3tX；下摄苗培井(t50r呻)5天．产酶水平较 稍作用． 美■一几T赢碱性J盯展鼻，鬣■链霉■ 几丁质又称甲壳索，在自然界中含量十分丰富。年生成约有一百亿吨，占天然聚合物 储置的第二位，仅次于纤维素。几丁质是一些生物如真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的重 簧的结构物质。几丁质在几丁质酶幕的协同连续催化下可完全降解为几丁单糖或几丁寡 糖。几丁质酶爰其几丁质的降解产物能广泛应用于食品、饲料加工、医药制造等方面，尤 其在生物防治上其前景更为诱人。n-21因此．国内外对几丁质酶的研究发展十分迅速。依 据其最适作用酸碱度不同可将几丁质酶分为酸性、中性和碱性三大类。TsujiboH．”1黄 秀梨【‘】、张玉蔫【”、夏国庆【q等分剐研究了中性和酸性几丁质酶的性质。本文首次报道 了灰褐链毒菌所产碱性几丁魇酶的纯化和粗酶的酶学特性。 1材料和方法 1．2培养基 1．2．1菌种斜面培养基为pH．9．0的高氏一号培养基(用NaC03调节pH值)。 60 0．2·№x-IPO,1．0，Twin0．005；NazCO，ll(单独灭菌，pH值11) 1．3研究方法 1．3．1 ·目家辩叠生暂工程中心．。九五‘班兼璜目(墙号96一cml．．02一Or) ¨理在工作单位t河南省用口鱼区拄来苴鲁局． ——344—— 陈亚成等： 灰揭链霉菌想Knkeo^uscusS1001)碱性几丁质酶的纯化及酶学性质研究 150rpm下振荡培莽5天。(在此条件下$1001产酶水平稳定在20u／m1)。 1．3．2粗酶液的制取，发酵液经3000rpm离心除菌，上清液经透析袋浓缩后即为粗酶 液。 1．3．3碱性几丁质酶之纯化 将粗酶液经sephadex PAGE鉴定该酶之纯度。 1．3．4酶活测定方法。铁氟化钾法，(ImotoTagi法)【，】。 相当于1／,gNAG的还原糖所需之酶量为一个酶活单位。 1．4试剂和材料 Sephadex 白(SSA)为进口分装；丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺华美生物公司．缓冲液系统：pH5．8～ 1．5叠白质浓度潮定采用紫外分光光度法 1．6酶学特性研究方法。参考文献[” 2结果与分析 2．1奠的纯化 2．1．1SephadexG一100凝胶过滤。结果表明，用SephadexG一100进行凝胶过滤，在 280nm处有两个吸收峰。其中第—个峰的峰值较低，经测定没有几丁质酶活。而另一峰 值较大，峰形对称，蛋白质洗脱集中，经测定酶活极高．且酶活峰形与A280峰形相对应。 将上述有酶活力的试管合并，测定其聋自质浓度和酶活力，从而计算其总蛋白和总酶 活，用以计算比活力和回收率。 S1001几丁质酶经Sephadex 280am处仅得銎卜卟吸收峰，且该峰是在缓冲液系统中添加了0—0．6mol／e梯度洗脱后 出现的。经测定具有几丁质酶活。 上述各步分离纯化结果列于表2—1中。由表2一l可见。酶液经浓缩和两步分离后 一定纯度o 2．1．2凝胶电泳鉴定纯度 -选用中性不连续系统进行盘状电泳，结果表明粗酶经两步分离纯化，电泳鉴定只有一 条区带。 一345— 第二屈垒国发酵工程学术对沦会论文集 1998 表2—1S1001菌株碱性几丁质酶的纯化 of of Table2—1Purificationthealkalinechltinase S1001 griseofuscus 总酶活 总蛋白