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2005年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会 学术交流
8．浙江地区青霉素耐药肺炎链球菌PBPs基因及
氨基酸序列研究
浙江省温州医学院附属温岭医院(317500)林峰 郑敏巧 曾爱平 丁玎
军事医学科学院放射医学研究所 文思远 王升启
bindingprotein
药的主要原因。
PBPs是一种广泛存在于革兰阴性和革兰阳性菌的膜结合蛋白，在细菌细胞壁的生物
合成、细胞分裂、细胞移动过程中发挥重要作用，同时PBPs也是0内酰胺类抗生素的作
用靶标。国内鲜见对耐药肺炎链球菌的PBPs基因的点突变及重组突变研究的相关报
的突变情况和特点，为今后对PRSP进行基因水平的分子诊断和指导临床合理用药奠定
基础。
材料和方法
一、肺炎链球菌的分离、鉴定和药物敏感试验
1．标准菌株：ATCC49619
肺炎链球菌。菌株均取材于儿科病房患儿的痰液或咽拭子，做细菌培养和分离。分离出
的菌株用奥普托欣试验、乳集凝集试验和菊糖发酵试验对菌株进行最终鉴定。
标准为NCCLS规定的最低抑菌浓度(minimalinhitory
0．064,ag／ml，中介0．12～1．0／tg／ml，耐药≥2．0pg／m1)。
二、PBP基因测序
1．DNA样品：用煮沸法从菌液中提取z6株肺炎链球菌的基因组DNA，用紫外分光
光度计(Du@640，Beckmancoulter)定量后冻存于一20。备用。
2．PCR扩增引物及测序引物：引物采用标准亚磷酰胺化学方法在DNA自动合成仪
(ABi8909)上合成(引物序列及用途表略)。
3．PCR反应：50肛l反应体系中含有200弘MdNTP，1肛M上游引物，l肛M下游引物，
40ng基因组DNA，I×PeR缓冲液，2．0mmol／LM92+离子和1．5U
ExTaq聚合酶。PCR
一63—
学术交流 2005年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会
sec／60。C)延伸
sec／946C)，退火(40
条件设置为：预变性(5min／94*C)；35个循环；变性(40
(80
sec／72℃)；延伸：7min／72℃。
PRISM ReactionKit
Cycle Ready
序反应试剂盒为ABI Sequencing
BigDye“．Terminator
with polymerase，FS(Applied
AmpliTaq。DNA
377—96DNA
Sequencer。测序得到的基因片段拼接为完整的PBPs基因。
三、序列比对与分析 ’
NTISUITE
序列比对与分析采用软件VECTOR 9．0和网上BLAST软件
结 果
一、26株肺炎链球菌的血清型和青霉素敏感性结果
PRSP。
寰1 26椿肺炎链球蕾的青霉蠢的药t彗暴
菌株 MIC(pg／m1) 菌株 MIC(pg／m1) 菌株 NIIC(gg／m1)
0．047
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