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链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法 蔡金华，刘雅妮，顾欣 （上海市兽药饲料监察所，上海 201103） [摘要] 目的 建立链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法。方法 采用微生物测定法定量检测牛奶中链霉素残留量，样品前处理用10%（m/v）三氯乙酸作为提取液，采用冷冻离心，使牛奶中残留链霉素得到提取和分离。结果 链霉素在0.10~3.(20u/mL的浓度范围内具有良好线性关系（r=0.9981）,牛奶中3种添加浓度0.20、0.80、1.60 u/g的平均回收率为 97.6%（n=9）， 3种添加浓度0.20、0.80、1.60u/g 各自的RSD为：1.6 %，3.7 %，1.2 %（n=3）。结论 本方法可用于牛奶中链霉素残留的检测。 [关键词] 链霉素；牛奶；微生物学检测；三氯乙酸；冷冻离心 链霉素属于氨基糖苷类抗生素，用于革兰氏阴性菌和结核杆菌感染，在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要作用，但抗生素的耐药性日益增强，并且毒副作用比较大[1]。为了加强兽药残留管理工作，保证畜产品质量安全，农业部于1999年发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知，并规定牛奶中链霉素的最高残留限量（MRL）为200 ug/kg。然而，相应的链霉素检测技术并不完备，由于氨基糖苷抗生素缺少发色基团，应用到HPLC时常要对其衍生化，设备条件过高，难以普及；并且其理化测定方法相当复杂和通用性差[2]。本文采用被测样品经10%（m/v）三氯乙酸提取液震荡、浸泡，冷冻离心，沉淀，将样品中的链霉素提取于上清液中，再以枯草芽孢杆菌为检定菌，用微生物检定一剂量法测定链霉素的残留量。 1 材料和设备 1.1 试药 链霉素标准品（中国药品生物制品鉴定所 批号：0308-200012 含量：731u/mg），其余均为分析纯。 1.2 试剂 10%（m/v）三氯乙酸，25%（m/v）NaOH ，0.2mol/L NaOH，0.1mol/L磷酸，磷酸盐缓冲液（PH7.8）， 链霉素标准品贮备液（精密称取适量标准品，用磷酸盐缓冲液（PH7.8）溶解，配成1000u/mL浓度的溶液）。 1.3 培养基 营养琼脂培养基（PH7.2）（《中国兽药典》二000年版 附录68页），抗生素检定培养基II（PH8.0）（《中国兽药典》二000年版 附录68页）。 1.4 试验菌种 枯草芽孢杆菌（BaciLLus SubtiLis,CMCC 63501）。 1.5 牛津杯 不锈钢管（外径（7.8±0.1）mm，内径（6.0±0.1）mm，高（10±0.1）mm）。 1.6 设备 高速冷冻离心机(Sigma公司)，高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY），生化培养箱(SANYO公司)，抑菌圈测定仪ZY-300IV（北京先驱威锋技术开发公司）。 2 方法 2.1 菌悬液的制备 取工作用菌斜面，用适量无菌生理盐水洗下菌苔，接种于盛有200mL营养琼脂培养基的克氏瓶中，（36±1）°C培养72h，当有80%芽孢形成时停止培养，用40mL无菌生理盐水洗下菌苔制成菌悬液，装入无菌试管中，于65°C水浴中加热30min,此菌悬液置4°C冰箱中保存备用，可使用30 d。 2.2 双蝶制备 取平底双蝶，注入15mL抗生素检定培养基II（PH8.0）,待其凝固，作为底层，另取抗生素检定培养基II（PH8.0）适量加热融化，放冷至60°C，加入菌悬液适量，摇匀，在每一个双蝶中分别加入5mL，在底层上均匀摊布，作为菌层。 2.3 菌种菌悬液用量测定和最低检测限确定 将不同量的同一菌悬液分别加到抗生素检定培养基II中，作为菌层，制备检定用双碟，在双碟上放置钢管，并注入250uL 0.10 u/mL工作标准液，于（36±1）°C恒温培养（16±1）h，以产生10.00mm以上清晰完整的抑菌圈者为最适菌悬液用量，并以0.10u/mL链霉素浓度为最低检测限，可以满足牛奶中链霉素残留分析。 2.4标准曲线回归方程制备 用磷酸盐缓冲液（PH7.8）作为稀释液，采用抗生素一剂量标准曲线法，即取链霉素标准品贮备液（1000u/mL）稀释成100 u/mL，再把100 u/mL标准品溶液稀释成10u/mL，最后，10u/mL标准品溶液分别稀释成所需的各个工作标准浓度点（0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 u/mL），中心浓度标准液设为0.80u/mL。每个工作标准浓度点制备3个碟子，在每个碟子中，间隔的3个钢管分别滴入250uL中心浓度标准液，另间隔的3个钢管分别滴入250uL工作标准浓度液，于（36±1）°C恒温培养（16±1）h。用抑菌圈测定仪测量抑菌直径，由电脑软件得到回归方程式和标准曲线图。 2.5 样品提取分离和浓度测定 把保存在4°C或温度更低的牛奶样品放到室温恒温，称取8.0 g牛奶于30