小鼠胎肝间充质干细胞在缺血脑组织中迁移机制地研究.pdfVIP

下取妊娠12．5天胎鼠生殖嵴及周围组织，4％多位于腹后壁，左右对称。生殖嵴位于中肾嵴内 聚甲醛固定，梯度脱水，透明，浸蜡，包埋，连 侧，较中肾嵴细而短。免疫组化显示阶段特异性 续切片。HE染色光镜观察形态位置。石蜡切片 胚胎抗原SSEA一1染色阳性的细胞出现在生殖嵴． 常规脱蜡入水，热修复抗原，按免疫组化SP法 内、生殖嵴与腹后壁及生殖嵴与中肾嵴连接的间 检测阶段特异性胚胎抗原SSEA—l，观察原始生 充质中，另外中肾嵴内也有少量SSEA一1阳性细 殖细胞分布。2．PGCs分离：无菌取妊娠12．5天 胞。2．刚分离的PGCs与体细胞均匀分布，但单 胎鼠，D—PBS浸泡，解剖显微镜下取生殖嵴及个PGC较体细胞大，核浆比例大。12—24小时 周围组织，D—PBS冲洗后眼科剪剪碎，0．25％ 后成纤维细胞贴满培养瓶(tm)底，其表面可见 胰酶一0．02％EDTA 37℃消化8—10min，等量细 到少量的鸟巢状或圆形边界清楚的EG细胞集落． 胞培养液中止消化。反复吹打，离心。调整细胞 同时还可见到大量的PGCs边聚集边增殖形成的 浓度，置370C，5％CO：饱和湿度下培养。3．胎小集落。2—3天后EG细胞集落数量明显增多。 fibroblast， 鼠成纤维细胞(murineembryonic 体积增大，形态多样，集落内细胞核浆比例大． MEF)饲养层制备：取三代内对数生长期MEF，排列紧密，边界不清，但所有集落与周围细胞边 界清楚，呈典型的胚胎干细胞样集落。与成纤维 终浓度lOt,,s／ml丝裂霉素C处理3．5h，D—PBS 充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为2×105／nd，细胞一起消化种植于新制备饲养层上，3—5天可 种植在经0．1％明胶包被的四孔培养板中，置 见多个EG集落出现。3．取第5代细胞染色，可 见EG细胞集落碱性磷酸酶染色强阳性。阶段特 370C、5％CO：培养箱培养待用，用前更换成胚 异性胚胎抗原SSEA一1免疫组化SP法检测EG 胎干细胞培养基。4．胚胎生殖细胞(embryonic germcell，EG细胞)传代：2—3天待较多体积细胞内可见强阳性棕黄色颗粒；免疫荧光检测 足够大的EG集落出现即传代。0．125％胰酶一EG细胞呈现绿色荧光。体外分化实验结果显示 EG细胞可分化形成囊状类胚体。 0．02％EDTA消化，镜下观察细胞稍有变形收缩 时终止消化，轻微机械吹打后离心，细胞种植于 结论：生殖嵴与其周围组织共培养结合常用 新鲜制备的饲养层上，3～5天后连续传代。5． 的饲养层培养方法能有效地分离克隆到小鼠的 EG鉴定：培养细胞经4％多聚甲醛固定后进行碱 EG细胞，为小鼠的EG细胞培养体系的完善以及 SP 性磷酸酶染色，阶段特异性胚胎抗原SSEA一1 建系工作提供了实验依据；同时建立起来的 法免疫组化及免疫荧光染色，体外分化实验检测 PGCs体外扩增平台能为深人研究小鼠PGC8起 EG细胞分化能力。 源、发育分化，尤其是有关PCrC8发育分化的特 结果：1．解剖显微镜下观察妊娠12．5天生异性决定因子的时序调控以及EG细胞的增殖分 殖嵴与中肾嵴已经完全分离，呈长椭圆形隆起。 化基因调控等问题提供有利的保障。 098 小鼠胎肝间充质干细胞在缺血脑组织中迁移机制的研究 暨南大学医学院血液病研究所广州510632