小鼠体外受精胚胎OPS法玻璃化冷冻保存地研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 小鼠体外受精胚胎OPS法玻璃化冷冻保存的研究 周光斌，朱士恩，杨其恩 (中国农业大学动物科技学院动物胚胎生物技术实验室北京100094) 摘要：本实验对小鼠胚胎进行了OPS法玻璃化冷冻保存，旨在系统地研究两步OPS法冷冻对不 通过观察其形态正常率、囊胚发育率、扩张囊胚发育率、孵化囊胚发育率和移植后产仔率、妊娠率 来综合判断其体内外发育能力。结果表明：原核胚解冻后囊胚率扣孵化囊胚率(40．0％和32．7％) 低于其它各个发育阶段的胚胎，并且与对照组有显著差异。2．细胞，4细胞，8一细胞，桑椹胚冷冻保 存后其囊胚率和孵化囊胚率在不同发育阶段无显著差异(PO．05o而囊胚的冻融后，其孵化率显著 低于对照组。各个发育阶段中，冷冻胚胎移植后产仔率最高的是2．细胞胚(57．1％)，与对照组(61．6％) 差异不显著(PO，05)。以上数据表明，两步OPS法玻璃化冷冻方案适合于2．细胞至桑椹胚各阶段 体外受精胚胎的冷冻保存。 关键词：玻璃化冷冻；体外受精；胚胎；发育阶段；小鼠 体外受精是人类辅助生育技术的主要内容，在治疗人类不孕不育方面起到了很重要的作用，动 物生产上，体外受精技术的成熟和完善使得利用屠宰场卵巢大规模生产动物胚胎成为可能。冷冻技 术，尤其是用时少，费用低，效率高的玻璃化冷冻技术的引入，可以为体外受精提供更好的支持。 比如，人类辅助生育过程中剩余胚胎的冷冻保存等，有利于家畜胚胎商业化运作的长期和短期冷冻 保存，在实验动物保存方面，冷冻保存和低温保存动物胚胎是维持一些重要的实验动物品种、品系和 et 血统的有效途径(Glenistera1．，1990)。 玻璃化冷冻保存人和家畜胚胎获得了广泛的成功，如人原核胚，2一细胞胚胎，4一细胞胚胎，8一 细胞胚胎，桑椹胚，囊胚以及孵化囊胚成功保存并有婴儿诞生(Yokotaetal．，2000；E1．Danasourietal．， 2001；Mukaidaetal，2001)，家畜各期胚胎在不同实验室冷冻成功。实验动物方面，大鼠体内各发育 而得到普遍应用(Vajta，2000)。 然而，冷冻体内胚胎时。由于不同实验室和不同条件下完成的实验得出了不同的结论，甚至是 相反的结论，为规范化和标准化玻璃化冷冻方法，特别是冷冻液的筛选，冷冻方法的选择和胚胎冷 冻保存最佳发育阶段的研究等。所以，有必要在同一条件下进行系统的研究。截止目前，虽然小鼠 体内胚胎均成功保存，但体外胚胎对冷冻保存更为敏感，有和体内胚胎不同的特性，尚未看到体外 两步法对小鼠体外受精各发育阶段的胚胎进行冷冻保存，用体外发育，胚胎移植和囊胚染色为技术 手段判断冷冻胚胎的发育潜力，以研究小鼠体外受精胚胎在相同条件下冷冻保存的最佳发育阶段， 为人类和其他动物体外受精胚胎的玻璃化冷冻保存提供参考。 1材料和方法 所有化学试剂未经特别说明均购自Sigma公司。 周光斌(1974-)，男，在读博士研究生 朱士恩，通讯作者，Email：zhushien@cau．edu．cn 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 1．1OPS管制备及溶液配制 0．1rnm，管壁厚度约为0．05mm。待冷却后用手术刀片在其细端切开，细端长度为2cm左右。 Ethylene 1．2体外受精胚胎的收集 7—11周龄的昆明白系雌鼠(中国科学院遗传所实验动物中心)，自由采食和饮水，室温20-t-2 处死，用M2液从输卵管冲取卵丘颗粒细胞复合体(COCs)，用HTF液冲洗三次后进行体外受精。 h后换 精液取自公鼠附睾，提前1h置于H瞪液中获能，精子密度为2—6×106／mL。精卵共同孵育6 胎、桑椹胚和囊胚。 1．3胚胎的玻璃化冷冻保存和解冻 胚胎操作是在37C的恒温台上进行。 个OPS中装4．6枚胚胎。 解冻前2h将解冻液和PBS液放到37℃恒温台上。将OPS由液氮中取出后，直接浸入含有 再移入0．25m01／L蔗糖液滴中平衡2min经二步稀释后脱去抗冻保护剂，用PBS液三次洗净后用于 体外培养或胚胎移植。 1．4解冻后胚胎发育能力的检测 1．4．1体外发育实验 不同类型的胚胎解冻后观察其存活率，囊胚发育率，孵化囊胚发育率判断其在体外的发育