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胡杨细胞耐盐机理及其液泡膜H+-ATPase的研究 （作者：刘群录 导师：蒋湘宁） 摘要 胡杨在我国主要分布于西北部荒漠、半荒漠地区的边缘，具有很强的抗逆能力，尤其抗干旱和盐碱。它是这一地区唯一可以形成森林的乔木树种，对维持当地生态平衡起着不可替代的重要作用，也是研究木本植物抗逆机制不可多得的珍贵材料。为了深入研究胡杨的耐盐机制，我们首次建立了胡杨细胞的悬浮培养体系，并研究了胡杨细胞的耐盐性；通过X-射线微区分析发现胡杨细胞具有分室渗透调节的耐盐机制；利用蔗糖密度梯度离心我们首次成功分离了胡杨液泡膜微囊，并且系统研究了胡杨液泡膜H+-ATPase的生化性质及其与胡杨离子区隔化的关系；通过DPH荧光标记和气相色谱法，研究了胡杨液泡膜和质膜流动性及膜脂不饱和度在盐胁迫中的变化，并探讨了这些变化与胡杨耐盐性的关系。一系列的研究成果较为深入地阐明了胡杨细胞的耐盐机制。主要结果如下： 1、在胡杨的悬浮培养中发现，初始接种量为0.5%，0.9%和1.5%时，细胞生长缓慢；当细胞接种量增至3.5%时，细胞增殖明显加快，生长曲线呈“S”形，接种后第5d到第12d细胞进入对数生长期，因而胡杨细胞悬浮培养的初始接种量以3.5%为宜。接种细胞后，培养基中的蔗糖含量迅速下降，3d后浓度几近于0；而单糖含量则迅速上升，到第5d时达到最大值，随细胞进入对数生长期又迅速下降。因而推测胡杨细胞可能分泌了高活性的蔗糖酶，将蔗糖水解为单糖，然后再加以利用。 2．盐胁迫实验的结果表明：胡杨细胞的生长率在50mmol/L NaCl处理下提高了52.9%，可溶性蛋白含量提高了16.0%。说明胡杨具有某些盐生植物的特点。然而50mmol/L NaCl处理却强烈抑制了毛白杨细胞的生长。说明在细胞水平上，胡杨细胞比毛白杨细胞具有更高的耐盐性。137mmol/L NaCl（-6.6bar）抑制了胡杨细胞的生长；而水势更低的25％PEG处理（-12.5bar）并不影响胡杨细胞的生长。这一方面说明高盐胁迫对胡杨细胞的危害主要是离子毒害作用，也说明胡杨细胞具有较强的抵抗渗透胁迫的能力。 3、利用X-射线微区分析发现：胡杨细胞质和液泡中盐离子浓度均随胁迫程度的增加而上升。但液泡中的浓度显著高于细胞质中的，液泡中Na＋浓度可达细胞质中离子浓度的1.2－1.8倍。而毒性更大的Cl- 在细胞中的区隔化程度更大，在盐胁迫下其在液泡中的浓度可达细胞质中的1.5-3.2倍。由于液泡可占成熟细胞总体积的90%以上，这样在盐胁迫下，胡杨细胞可将进入体内的大部分盐离子积累到液泡中。同时发现：胡杨细胞在受到盐胁迫后脯氨酸含量增加。在50和137mmol/L NaCl处理中分别比对照提高了82.5%和34.4%；并且脯氨酸的含量随盐胁迫时间的延长而增加。这些结果说明：胡杨细胞在盐胁迫下，可通过离子区隔化将细胞质中过多的盐离子隔离在液泡中，以降低细胞质中盐离子的浓度，减小盐离子对细胞质的毒害作用；积累在液泡中的离子还可被胡杨细胞用以渗透调节。在细胞质中，脯氨酸的含量增加，平衡了液泡和环境中盐离子的渗透压，并保护细胞质中的生物大分子免受盐离子的毒害。这就是胡杨细胞中分室渗透调节的耐盐机制。毛白杨细胞中由于缺乏这种机制，因而其耐盐性比较低。另外，胡杨细胞在受到盐胁迫后K＋和Mg2＋的浓度有一定程度的上升，说明胡杨细胞在盐胁迫下具有一定选择吸收有益元素的能力，这也是胡杨细胞耐盐机制的一个方面。 4、通过测定焦磷酸酶质子转运活性和ATP酶对NO3-、VO43-和NaN3的敏感性，发现液泡膜微囊主要分布在0～25％的蔗糖界面上。通过比较研磨、捣碎和超声破碎这三种细胞破碎方法对蛋白产率、酶活性和反应潜势的影响，发现捣碎法破碎细胞，结合差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心所纯化的液泡膜封闭性好，酶活力高，膜翻转率比较低，蛋白得率较高，是一种比较好的分离纯化胡杨细胞液泡膜微囊的方法。 5、通过检测吖啶橙的荧光淬灭，研究了胡杨液泡膜H＋-ATPase的生化性质。结果表明，胡杨液泡膜质子转运活性依赖于ATP，其表观米氏常数Km，app为0.65mmol/L。在pH7.5时质子转运活性最高。随温度的升高，吖啶橙荧光淬灭的初速度增加；但由于膜微囊渗漏程度增大，荧光下降程度减小。二价阳离子可以启动质子转运，其中Mg2+ 的作用远远大于Fe2+，而Ca2+、Mn2+和Cu2+ 则没有启动作用。一价阴离子对胡杨液泡膜H＋-ATPase的质子转运具有激活作用，激活作用的顺序为Cl- Br- F- 。I- 由于可淬灭吖啶橙的荧光而不适用于这种方法。胡杨液泡膜质子转运活性可被NEM和DCCD抑制，还可被囊泡型H＋-ATPase的专一性抑制剂NO3- 和Bafilomycin A1强烈抑制，但对NaN3和Na3VO4不敏感。这些结果说明胡杨液泡膜