分子生物学实验指导-第二次.docVIP

实验二 水稻WRKY基因PCR扩增及其检测 一、背景知识 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是当前分子生物学最基本和最重要的技术之一。PCR的应用非常广泛，如基因扩增和分子标记，涉及基础研究和应用研究两方面，在现农业和生物医学等领域发挥着至关重要的作用。 在高温条件下（90 oC – 96 oC），双链DNA模板变性解链，氢键断裂，形成单链DNA（变性）。当温度降低后（25 oC – 65 oC），引物与DNA模板结合（退火），形成局部双链，然后在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，在合适温度条件下（68 oC – 72 oC），DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链（延伸）。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物，加入DNA聚合酶、dNTP，就可以完成特定基因的体外复制。每一循环，经过变性、退火和延伸，DNA含量增加一倍。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至9左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。DNA模板（DNA） 10×PCR buffer、dNTPs (2.5 mM)、引物(10 μM)、Taq酶（5 U/μl）、无菌水6 ×电泳上样缓冲液、50 × TAE电泳缓冲液、溴化乙锭EB、TE缓冲液。 碎冰、PCR薄壁管、普通台式离心机、移液枪及Tip头、PCR仪、锥形瓶、电子天平、微波炉、电泳槽、电泳仪、紫外成像仪紫外。DNA溶液稀释20-30倍后，测定OD 260/O D280比值，明确DNA的含量和质量。 OD 260/OD 280≈ 1.8， 若大于1.8，说明有RNA污染；小于1.8，有蛋白质污染。 样品浓度(mg/ml)=OD260×稀释倍数×50 (2) 取2 ?l在0.8% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。 1) 取150 ml锥形瓶，用电子天平称取琼脂糖0.4 g； 2) 加入1 × TAE电泳缓冲液50 ml (即0.8 %琼脂糖)；用微波炉融化，混匀； 3) 准备胶板，置梳子，倒胶约25 ml (50-60 oC)，冷却凝固； 4) 置胶板于微型电泳槽后，倒入1×TAE电泳缓冲液； 5) 点样，电泳（55 V / 40 min）； 6) 紫外成像并分析。 (二) 水稻WRKY基因的PCR扩增 (1) 建立PCR反应体系 在0.2 ml PCR管中建立25μl总反应体系，置冰浴加各组分： 10×PCR buffer 2.5 μl MgCl2 (25 mM) 2.0 μl dNTPs (2.5 mM) 1.0 μl 正向引物 (10 μM) 0.5 μl 反向引物 (10 μM) 0.5 μl Taq酶（5 U/μl） 0.2 μl 模板DNA 1.0 μl 补充无菌水至 → 25 μl * 注意：模板DNA来自实验一中提取的水稻基因组DNA，一般来说可以稀释5倍； 以上操作最好在冰上进行。 (2) 设置PCR热循环程序 95 oC 5 min（预变性） 94 oC 30（变性） 53 oC 30s （ 退火）72 oC 1 min（延伸） 72 oC 10 minoC 5 min (3) PCR热循环反应 将PCR管简单离心后，放入PCR仪进行PCR热循环。 (4) PCR产物检测 加入loading buffer，进行琼脂糖水平电泳检测 [同上]。 六、实验结果与报告 1. 请记录你所提取的水稻基因组DNA的量。 2. 请记录水稻WRKY基因的PCR扩增结果。 七、思考题 试述PCR扩增的注意事项 引物设计原则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2.引物长度一般在15~30碱基之间。3