强直性脊柱炎患者外周血白细胞Toll样受体4与血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达改变及其临床意义研究.pdfVIP

专题报告 全国免疫学与分子生物学技术新进展研讨会 强直性脊柱炎患者外周血白细胞ToU样受体4和血清可溶性肿瘤坏死因， 相关凋亡诱导配体的表达改变及其临床意义研究 第二军医大学附属长征医院实验诊断科(上海200003)扬再兴梁艳朱烨李畅何铭君张玲珍仲人前 强直性脊柱炎(anl【yl∞iIlg 病因和发病机制目前尚不明确。一般认为。AS为多因素遗传，并与生殖泌尿系及肠道G-细菌感染密切相关。比如肺炎克 雷白杆菌。ToU样受体(Tou-like receptor，TLR)属于一种病原微生物模式识别受体，在宿主对微生物感染的防御中起重 要作用。其中，TLR4以G细菌LPs以及透明质酸、热休克蛋白等内外源性物质为配体。其信号通路活化后，可产生T胁 口、琢‘M7、Ⅱ，12等多种促炎症因子，引起机体局部或全身性的自身免疫性炎症损伤[1]。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配 体(TNF．relatedapoptosis_in“cing 溶型(8TRA几)两种形式．其异常表达与1型糖尿病[3]、系统性红斑狼疮口]等多种自身免疫性疾病的发病和炎症发展有 关。目前，关于TLR4及其信号通路以及TRA儿与AS发病的关系，国内外尚无文献报道。本研究检测As患者外周血自 细胞TLR4和血清sTRAn的表达水平，并探讨了其与As的关系。 材料与方法 史和家族史，排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病表现。 2000DNALadder pGEM-T载体试剂盒(美国Promega公司)，DL 成。QPREP标本处理仪和流式细胞仪(美国Comter公司)，ABI BEHE玳G公司)。ESR自动化分析仪(意大利E1ectaLab公司)． stain 以QPREP标本处理仪裂解红细胞，离心后弃上清液，以2nllb证{er(pH7．4的磷酸盐缓冲液加2％的小牛血清和O． buffer重悬细胞后上流式细胞仪检测，同时设不加标记抗体的阴性对照管。 1％的叠氮钠)洗2遍，以500正Stain 表1 TI尿4和8-ac咖基因引物和探针序列 5．分离PBMC8和制备细胞总RNA；抗凝血以等体积生理盐水稀释后，以淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离单 个核细胞。收集细胞沉淀，提取总RNA，操作按照试剂盒说明书进行．以1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪，检测所 一178— 全国免或学与分子生曲学擅术新进展研讨台 灌2一，总RNA cDNA 6正。反应条件为50℃2…95℃2…，然后95℃1驰，60℃1…40十循环。 6克隆锶备定量目的片段模板和内参照模板TLR4和争ac弧的PcR产物干1．5％璩脂糖凝腔电辣，脏回收、纯化， TLR4和pGE*T—pact‰PCR法鉴定阳性克隆，并测序。 7配置标准摸棱厦路箭标准曲线；上进重组盾粒经紫井分光光度仪测定藏虚，并捶算为拷贝致／出，以灭菌双燕承梯 度稀释为1×10一、10’、1口、107，105，1旷、10‘、103拷贝救，出辱不同浓度的楗板．行宴时荧光定量逆转录(RT)一PcR。反应 PcR 体系50一．台Pkt…Q删tBtmsuperMlFuDG 95℃】55，60℃1…4。十循环。反应结束后电脑scq…cer)c哑non却stem自动绘出标准曲线。 转录戚cDNAl并与TLR4和}ac恤标准模板～起在ABIPmm7∞o上扩增。匣应结柬后．电脑计算出各样车的TLR4基 因爰内参争咖的拷贝披。 10 永平，方法为建率戢射比浊法。 11．统计学分析所有统计学分析均采用sPsSloo软件。数据mz±，表示．不同组计量资料同的比较采用‘柱验；应 用sp…法分析不同组数据同的相莞性；以Po05为差异有统计学意义。 结 粜 ‰隐誊)～ 塞㈣}。～ 注L=lymph。cytes，M…∞叫tes，N= 01 c。ntfols 注：P001Ⅲsushealth娜ntrols 删ropⅫ8}’P0ve…11ealt}ly T