大肠菌群的检测.pptVIP

大肠菌群的存在 早在19世纪末就有人用检查大肠杆菌的办法来确定水中有无伤寒沙门氏菌。水受到沙门氏菌的污染，有时水中该菌的数量很少，不易直接检查出来。若水中检出一定数量的大肠杆菌，则说明水已被粪便污染 正常粪便中的细菌种类很多，但符合理想指标菌条件和特性的细菌主要有3类群，即大肠杆菌、粪链球菌和产气荚膜梭菌。在粪便中大肠杆菌数量最多，每克粪便中可达30亿个。 大肠杆菌容易引发的疾病： 肠道外感染 　　多为内源性感染，以泌尿系感染为主，如 尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎 等。婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者，大肠杆菌可侵入血流，引起败血症。早产儿，尤其是生后30天内的新生儿，易患大肠杆菌性脑膜炎。 急性腹泻 　　某些血清型大肠杆菌能引起人类腹泻。其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般2～3天即愈，营养不良者可达数周，也可反复发作。肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。此外，肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。 检样 测定大肠菌群检验常用器材 测定大肠菌群多用培养基和器材主要有单料乳糖胆盐，伊红美蓝琼脂（EMB），EC肉汤，磷酸盐缓冲溶液，生理盐水，革兰氏染色液，恒温培养箱，恒温水浴锅，天平，显微镜，均质器或乳体，温度计，灭菌平皿（直径90mm），试管，广口瓶或三角瓶，吸管，载玻片，接种针，玻璃珠，酒精灯，试管架。 检验方法 一.检样稀释 取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同，做成均匀稀释液。同一稀释度在菌落总数测定的同时接种于乳糖胆盐复发酵管。 1) 以无菌操作取检样25mL（g），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体取样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~1000r＼min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2 用以灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有3mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 另取1mL灭菌试管，按上项操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释液1次即换用1支10mL吸管。 二.乳糖发酵试验 1）根据食品卫生标准要求或对检样污染程度的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。接种量在1mL以上者用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及以下者用单聊乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管。置（36+1.36-1）℃恒温箱内，培养（24+2. 24-2）h，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性。 经上述所说，如有产气者，将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂（EM琼脂）平板上划线分离，然后置（36+1 36-1 ）℃恒温箱内，培养18~24h后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 证实试验 挑取可疑大肠菌落1~2个进行革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落的另一部分，接种乳糖复发酵管。置（36+1. 36-1）℃恒温箱内，培养22~26H，观察产气情况。凡乳糖管产酸产气，证实有大肠菌群存在，即可报告为大肠菌群阳性。 大肠菌群可疑菌落的特点（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落。（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落，（3）淡紫黑色，中心色泽深的菌落。 注意事项： 1：如果平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实实验，以免出现假阳性。 2：在检验中应选用伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌落大多呈紫黑色，有金属光泽或无金属光泽。 3：挑取菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑取几个，以免出现假阴性。 4：对未产气的发酵管有疑问时，可以用收轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上浮，既应考虑有气体产生。做进一步实验观察。 * 稀释 乳糖胆盐发酵剂 培养（36+1℃），（24+2）h 产气 伊红美篮琼脂平板 培养（36+1）℃，（24+2）h 乳糖胆盐发酵管 培养（36+1℃）（24+2）h 不产气 大肠菌群阴性 报告 革兰氏染色 革兰氏阴性无芽孢杆菌 革兰氏阳性 大肠菌群阴性 报告 产气 不产气 大肠菌群阳性 报告 大肠菌群阴性 报告 大肠杆菌菌落 *