花椰菜抗黑腐病消减cDNA文库的构建和分析.pdfVIP

第 43卷 第 2期 南 开 大 学 学 报 (自然科学版) Vo1．43 N_O2 2010年 4月 ActaScientiarum Naturalium UniversitatisNankaiensis Apr．2010 文章编号 ：0465—7942(2010)02—0015—08 花椰菜抗黑腐病消减 eDNA文库的构建和分析 江汉民，郝 擘 ，于雪梅 ，李 爱 ，王春国，孙德岭。，宋文芹 (1．南开大学 生命科学学院，天津 300071；2．天津科润蔬菜研究所 ，天津 300384) 摘要：为全面探索花椰菜抗黑腐病的机理，以花椰菜抗黑腐病近等基因系C712(抗病系)和 C731(感病系) 为试验材料 ，构建了一个 C712受黑腐病菌诱导表达的正 向消减 eDNA文库 ，文库共包含 1476个 阳性克隆．经 斑点杂交筛选后选择了280个阳性克隆进行测序，获得 266条通读 ESTs．将获得的ESTs去除载体和接头序列 以及重复序列后 ，共得到 202条单一序列．利用 NCBI的BlastX软件对所得序列进行蛋 白序列 同源性 比对 ，结果 显示，182条序列在蛋 白数据库中可以找到同源序列，主要涉及物质及能量代谢、信号传导、转录调控、苯丙氨酸 代谢途径及防卫反应等方面．2O个ESTs在GenBank中没有查到对应 的同源序列 ，可能是新基 因．eDNA文库 的 构建为进一步研究花椰菜抗黑腐病相关基 因及抗病的分子机制奠定了基础． 关键词 ：花椰菜 (Brassicaoleraceawar．botrytis)；黑腐病 ；cDNA文库 ；抑制性消减杂交 中图分类号 ：Q75 文献标识码 ：A 0 引 言 花椰菜 (Brassicaoleraceavar．botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝的一个变种，具有较高的营养价值和一 定的抗癌功效 ，深受人们的喜爱 ，近年来在我 国的种植面积越来越大 ，但随着菜 田复种指数的提高和生态 条件的改变 ，由野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)引起的黑腐病的发病率越 来越高 ，为害 日趋严重 ，直接影响花椰菜花球的产量和品质 ，成为生产上迫切需要解决的问题．研究花椰菜 抗黑腐病 的机制 ，寻找抗病育种新方法是解决此问题的有效途径．抑制性消减杂交技术 (suppressionsub— tractivehybridization，SSH)是一种快速有效分离差异表达基因的方法 ，对高、低丰度的差异表达基 因均能 有效分离 川．以抗黑腐病的花椰菜 C712及其感病 的近等基 因系(near—isogeniclines，NILs)C731为材料， 利用 SSH技术富集在 Xcc侵染后抗黑腐病品系中差异表达的基 因，构建 ssHcDNA文库．通过基因功能 分析，初步 了解抗病花椰菜在与 Xcc的互作 中涉及的信号传导途径及抗病相关基因表达 的种类 、数量 以 及功能，为进一步认识花椰菜抗黑腐病的机制 ，挖掘和利用花椰菜重要抗病基因奠定基础． 1 材料与方法 1．1 材料 所采用的植物材料为一对花椰菜抗黑腐病的NILsC731和 C712品系 ，其 中C731为感病系作为回归 亲本 ，C712是供体亲本 C5与 C731杂交后得到的抗性植株 ，并与C731回交 6代得到的抗病系(BCeFz)． 所用致病菌为野油菜黄单胞菌 (Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)，以上材料 由天津科润蔬菜研 究所提供． 1．2 方法 1．2．1 材料的处理 ：供试材料的种子在 5O。C水中处理 10min，然后播种于装有灭菌土的营养钵 内，置于 温室 中．待植株长到 4片叶时，对植株进行处理．致病菌 的接种及样品的采集参照文献[2]进行． 收稿 日期 ：2009—02—18 基金项 目：国家 973计划前期研究专项 (2007CB116202) 作者简介 ：江汉 民(1981一)，男 ，山东青州人 ，博士研究生 ·16 · 南 开 大 学 学 报 (自然科学版) 第 43卷 1．2．2 叶片总 RNA 的提取与 mRNA 的分离、纯化