实验八液化型淀粉酶活力的测定.docVIP

实验八 液化型淀粉酶活力的测定 一、目的要求了解酶活力测定的意义掌握液化型淀粉酶的力测定的原理及方法原理液化型淀粉酶能催化淀粉水解生成小分子量的和少量麦牙糖及葡萄糖。本实验以碘的呈色反应来测定水解作用的速度，从而衡量酶活力的大小。、试剂与器材试剂：1. 原碘液：称取碘11 克，碘化钾22 克，加入少量水，使碘完全溶解后，定容至500ml , 贮于棕色瓶内。2. 稀碘液，取原碘液2 ml，加碘化钾20 克，用水溶解定容至500 ml，贮于棕色瓶内。 32 ％可溶性淀粉溶液：精确称取可溶性淀粉2克（以绝干计），用10 ml 水调匀，倾入90 ml 沸水中，再加热煮沸2～3分钟，使溶液透明为止，冷后定容至100 ml，此溶液需新鲜配制。4. 0 .02M 柠檬酸―磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0 ) ，称取柠檬酸（C6 H8O7· 2H2 Q ) 8.07 克，磷酸氢二钠45.23克，加水溶解并定容至1000 ml ，配制后用pH 计校正pH。 5标准“终点色”溶液(l) 精确称取氮化钻（COCl2 · 6H2O ) 40.2439克，重铬酸钾0.4878克，加水溶液并定容至500 ml。(2) 0.04%环铬黑溶液：精确称取铬黑 (C20H12N3NaO7S)40毫克，加水溶解并定容至100 ml。  取（l）液4ml与（2）液5.0 混合，即为标准“终点色”溶液。此宜冰箱保存，有效期为15天 器材：1. 调色板（白色）1 块2. 试管25×250mm l 支3. 恒温水浴锅l 只4. 烧杯100 ml l 只5. 容量瓶l 只6. 漏斗l 只7. 玻棒、滴管各1 支8. 吸管20 ml 1 支，50 ml l 支，0.5 ml l 支、操作1. 待测酶液的制备 准确称取酶粉2克，加入小烧杯内，用少量0.02 M 柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解，并用玻棒棒捣研，将上层清液倾入容量瓶内（容量瓶大小根据酶粉活力单位决定稀释倍数的选择）。残渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布（或滤纸）滤过即为待测之酶液。 如为液体样品，可直接过滤即取一定量滤液入容量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度，摇匀，备用。2. 测定（l）取标准“终点色”溶液2 ml，滴于调色板空穴内, 作为比较终点颜色的标准。(2）吸取2 可溶性淀粉20ml 及pH6.0 0.2M 柠檬酸—磷酸氢钠等冲液5 ml, 置于大试管中，在60 ℃ 恒温水浴中预热4 ～5 分钟．然后加入待测酶液0.5 ml，立即记录时间充分摇匀。定时用滴管从试管中取出反应液约05ml.滴于预先盛有稀碘液（约1.5 ml）的调色板室穴内，当穴内呈色反应由紫色逐渐变为红棕色，直至与标准”终点色”相同时，即为反应终点，并记录时间T（分）。计算1克酶粉（或l ml 酶液）于60 ℃，pH 6 . 0 的条件下，1小时液化可溶性淀粉的克粉，称为液化型淀粉酶的活力单位数，即：酶的活力单位=(60×20 ×2% ×n)/(T× 0.5)（克可溶性淀粉／克酶小时60 ℃ pH6.0）式中：T ― 反应时间（分）60分种换成小时20×2 % ― 可溶性淀粉的量（克） 0.5 ― 吸取待测酶液的量n ― 稀释倍数、注意1. 酶反应时间控制在2～2 . 5 分钟之内。否则，应改变稀释倍数重新测定2. 本试验中，吸取2 可溶性淀粉及酶液的量必须准确，否则误差较大。 思考题： l什么是酶活力？2如何进行酶的定性测定？如何进行酶的定量测定？ 3标准“终点色”的作用是什么？