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“设计性实验”项目申请书 项目名称从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定 项目负责人 李茹一 年级、专业 2010级 药物制剂 联系电话 电子邮件 387599688@ 填表日期 2012年10月16日 国家级生物实验教学示范中心制表 填表说明 1、本申请书适用于各门实验课程的设计实验。 2、《设计性项目申请书》要按顺序逐项填写。填写内容要实事求是，讲究诚信，不能有雷同；表达要明确、严谨。空缺项要填“无”。 3、格式要求： （1）一律用A4纸打印，于左侧装订成册。 （2）字体：中文用宋体，英文和数字用Times?New?Roman字体标题编排应采用分级编号标题编排应采用分级编号国家标准《文后参考文献著录规则》(GB7714-87) 项目名称 从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定 经 费 1500（元） 起止时间 2012年11月至 2012年12月 负责人 学号 姓名 年级 专业 联系电话 E-mail 李茹一 2010级 药物制剂387599688@ 一、立项背景和依据（包括研究目的、国内外研究现状分析、研究意义，应附主要参考文献） （一）研究目的（二）国内外研究现状分析（三）研究意义 （四）主要参考文献 Nisin产生菌的筛选及鉴定》 彭其安，王布匀，蒋磊，程勋 武汉科技学院环境与城建学院，武汉430073 3、《Nisin产生菌株的筛选及其鉴定》都立辉 霍贵成 刘芳 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 哈尔滨1 50050 4、《Nisin的生产、提纯和检测》 李增利 江苏科技大学生化部，镇江212004 5、百度百科等 N 二、项目研究内容（主要研究内容拟解决的关键问题（一）项目主要研究内容 （二）拟解决的关键问题（）、项目实施方案（研究思路技术路线、方法等）（一）研究思路 在平板中先铺一层琼脂培养基，待加热熔化的顶层琼脂降温至50℃左右，加入确定量的枯草杆菌，混合均匀，加入已经铺好底层琼脂的平板中，每个平板加5ml。待凝固后打孔。挑出孔内琼脂，往里面加入发酵液上清加平即可，每个菌株对应的发酵液做三组。再做一个空白对照平板。置于培养箱中培养两天。 ④测量抑菌圈直径 ⑤绘制标准曲线：因抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径（数学值）呈直线关系，因此根据抑菌圈的大小，可以求出相应的抗菌物质的效价。利用Nisin标准品，配置不同的浓度用琼脂扩散法测量对应的抑菌圈直径，然后绘制标准曲线。将④的实验结果根据标准曲线数据而得出不同菌株的产Nisin的能力大小。进而可以得知高产菌株是哪一株。 ⑥将选择出的高产菌株进行菌种保藏。并做好标记。及时进行传代。 3、生理生化反应 （1）淀粉水解实验 ①固体淀粉培养基灭菌后冷却至50℃,倒平板； ②用记号笔将平板分区，不同的区域接种不同的单菌落（2中使用过的菌落），记录接种的菌落标号； ③平板倒置在37℃培养24h; ④将平板打开，加入Lugol’s碘液，轻旋转，观察结果。 （2）糖发酵实验 取半固体葡萄糖发酵培养基试管，分别用接种针穿刺接入2中使用过的菌落和阴性对照，37 ℃ 培养24h。 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。 （3）吲哚实验 用接种环分别挑取各个单菌落到含有蛋白胨水培养基的试管中,将试管置37℃恒温培养箱中培养48h。向培养后的蛋白胨水培养基内加3-4滴乙醚，摇动数次，静置3min,待乙醚上升后，沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂。 在乙醚与培养物之间产生红色环状物的，为阳性反应，否则为阴性。 （4）V-P test（乙酰甲基甲醇试验） 以无菌操作分别挑取各个单菌落分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基（V-P test）试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中培养。培养2d后，将培养物内加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5% α-奈酚溶液，用力振荡，再放入37 ℃保温15-30 min, 若培养物呈红色，为V-P test 阳性。 （5）柠檬酸利用实验 挑取菌落分别接种于柠檬酸盐斜面上，置于37℃培养24-48小时。 观察柠檬酸盐培养基上有