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原位杂交流程 卢朝晖 整理 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针，对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有，但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的，因此特加以综合供同行参考，在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中，常常可以买到已经标记好的商品探针，那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去，从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次，可获满意结果。 主要操作步骤： 制备感受态细菌 用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定 大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒 电泳分离、回收及纯化 标记探针 石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理 抗体连接、显色 制备感受态细菌 【试剂及配制】 1．LB液体培养基 在900ml三蒸水中加入： 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g 磁力搅拌使完全溶解，用5mol NaOH调节pH至7.0（如用进口试剂则不必调）。定容为1000ml，高压灭菌20min。 2．0.1mol CaCl2溶液： 1.1g无水氯化钙，溶于90ml三蒸水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中，4℃保存。 【材料】 大肠杆菌单菌落或冻存菌种，也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。 【操作方法】 1．从37℃培养12～16h的平板中用无菌的接种环（用前酒精灯烧红晾凉）挑一单菌落，转入含有5ml LB培养基的无菌试管，37℃振摇 （200r/min）过夜。次日取菌液1ml加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶，37℃振摇培养（200～300r/min）约2～3h，将烧瓶取出立即置冰浴10～15min； 2．以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中； 3．4℃离心，5000g × 10min，回收细菌； 4．弃去培养液，将管倒置于滤纸上1min，流尽培养液； 5．用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体，置冰浴30min； 6．4℃离心，5000g × 10min，弃上清，倒置于滤纸上1min； 7．加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 ，重悬菌体，动作要轻； 8．置4℃冰箱12～24h，即可用于转化。 感受态细菌的冻存 一次制备的感受态不能用完，可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中，沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份，每份加30%体积的甘油，充分混匀，置-70℃冰箱，一年内可使用。 用含目的基因的质粒转化细菌 【试剂及配制】 1．LB液体培养基 2．氨苄青霉素（Amp）选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂（15g/L），高压灭菌20min，取出，在无菌条件下，冷却至50℃左右时（烧手但尚可忍受）加入抗生素或其他必需成分，如为氨苄青霉素（Amp）选择性培养基，则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入，即每ml培养基加入1μl氨基苄。 3．氨苄贮存液 将氨苄青霉素钠溶于三蒸水，配成50mg/ml溶液，以0.22μm滤纸过滤，1ml一份分装，存于-20℃。 【操作方法】 1．无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时，将其从-70℃冰箱取出，握于手中，待其解冻后立即吸取200μl 转移至10ml无菌玻璃试管中，剩余的感受态弃去，不能再冻存复用； 2．每管加质粒50～100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min； 3．42℃ 水浴热休克90s，不要摇动试管； 4．每管加无抗生素的LB培养基1ml，37℃摇床温和摇振（100～150r/min）45min； 5．用无菌的弯头玻璃铺菌器（用前酒精灯烧，再晾凉）将200μl菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃放置20min，然后倒置培养14～20h（37℃）。 小量培养转化的细菌 【操作方法】 1．取灭菌处理的10m