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基于PCR的SNP分型技术概述 华大基因 杨旭 聚合酶链反应（PCR）于二十世纪80年代由K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCR技术自诞生之后就给分子生物学研究带来了惊喜连连，早期单纯的DNA扩增到目前基因转录检测，转基因生物检测，肿瘤耐药性基因表达检测等多方面发挥着重要的作用。 PCR技术用于基因分型（genotyping）使基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化。 一、PCR反应原理和反应过程 一、PCR反应原理和反应过程 一、PCR反应原理和反应过程 SNP的定义及特点 单核苷酸多态性性( single nucleotide polymorphism, SNP)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA 序列多态性, 而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%。 它包括单碱基的转换, 颠换、插入及缺失等形式。不包括其它遗传变化，比如插入和缺失重复序列拷贝的变化等。 随着人类基因组测序工作的完成,单核苷酸多态性(SNP)的筛选及其检测正成为研究者们广泛关注的焦点。 为什么要研究SNP: SNP 被认为是一个物种中不同个体表型的主要遗传来源，是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式；是决定人们的疾病易感性和药物反应的决定因素，在疾病的易患病体质，对药物具有抗药性或药物过敏体质，以及临床上的个体差异现象中扮演了极其重要的角色 SNP 的遗传特点 高密度：300万 在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。 高保守：与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 富有代表性：某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 易实现分析的自动化：SNP 标记在人群中只有两种等位型(allele), 故也称为双等位标记(biallelic marker)。这样在检测时只需一个“ +/- ” 或“ 全/无” 的方式, 而无须象检测限制性片段长度多态性, 微卫星那样对片段的长度作出测量, 这使得基于SNP 的检测分析方法易实现自动化。 由于具有以上特点, SNP成为继RFL P (限制性片段长度多态性) , 微卫星(microsatellite) 多态标记后的第三代分子遗传标记。 SNP的分析 SNP作图(SNP mapping) ：在基因组序列上找到单核苷酸多态性位点 SNP分型(SNP genotyping) ：在大量的样本中测定每一个SNP的等位频率 对所得的数据进行连锁不平衡分析或关联分析，以找出其中所隐含的生物信息 基于PCR的SNP分型检测 一、 PCR-限制性片段长度多态性 PCR-RFLP：如果SNP 产生或消除了某个限制性内切酶位点, 则可以通过对PCR 产物酶切, 电泳后检测。估计有半数的SNP 并不导致酶切位点的改变, 在PCR中引入错配引物可克服这一不足。 突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，经过扩增后，所得PCR产物便含有该突变序列。 通过改变引物序列使扩增产物产生酶切位点。 一、 PCR-限制性片段长度多态性 用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，PCR产物能（或不能）被酶水解而产生不同长度的片段 根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段 最简单，只需要一对引物 一、 PCR-限制性片段长度多态性 二、单链构象多态性 单链DNA分子能在空间自发地形成二级结构，其空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链。 将PCR 扩增的待测片段与去离子甲酰胺混合，接着95 ℃变性解链，再骤冷到冰中，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，因而能区别正常与突变的DNA 二、单链构象多态性 二、单链构象多态性 局限性： DNA长度增加会使不同序列分子之间迁移率的差异减小而导致SSCP的敏感性降低 靶基因片段200bp 技术关键： 1.随着温度改变，导致复性；控制条件，避免复性 2.每次电泳都需在同一板电泳胶中以含纯合突变SNP、杂合子、正常的DNA 片段为参照片段，即作为电泳迁移率的阳性对照，待测的单链DNA 与阳性对照比较才能完成对SNP 的检测。 优点：技术简便，不需特殊设备以及可同时分析较大量样本 设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含有不同的Tm值 将PCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳