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基因文库技术分离目的基因 基因文库技术分离目的基因 所谓文库(1ibrary)是指一种全体的集合。基因文库(gene library)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA 片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌 落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生 物的基因文库。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起 来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个 基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以 需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复 杂基因组作图的重要依据。基因文库构建包括以下基本程序： ① DNA提取及片段化，或是 cDNA的合成。 ②载体的选择及制备。 ③ DNA片段或cDNA与载体连接。 ④重组体转化宿 主细胞。 ⑤转化细胞的筛选。当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。基 因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把 目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因还必须对其进行必要的检测与分析：如进行序 列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这 时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用 基因文库技术分离目的基因的主要内容。一、基因文库的类别 1． 基因组文库与cDNA文库 根据基因类型，基因文库可分为基因组文库及cDNA文库。基因组文库是指将某生物的全部 基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。cDNA文库是指某 生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的 集合。 基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文 库。 基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。文库构建时的信息供体 是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某 一特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该生物有机体的全部基 因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。再者，cDNA文库只反映mRNA的分子结 构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。 基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个 完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体 的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库 可真实地显示基因组的全部结构信息。目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。 选择哪一种，主要是根据实验目的。在分离RNA病毒基因，研究功能蛋白序列，分离特定发 育阶段或特定组织特异表达的基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及 基因组作图时必须构建核基因组文库。 2． 克隆文库及表达文库从基因文库的功能上看可 分为克隆文库及表达文库。克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择 标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元 件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中 表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。从 克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探 针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段 的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生 物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选 的目的基因的分离。 3．不同载体的基因文库 目前用于构建基因文库的载体主要有质粒、 噬菌体、黏粒及人工染色体四大类。每类中又有许多不同的载体。不同的载体适于构建不同 的基因文库。（1）． 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体。现已有各种适用于不同工 作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒。但在构建基因文库上，由于质粒相对较小并只能 容纳比自身更小的片段，因此它不能用于构建核基因组文库，通常只用来构建短序列的克隆 文库。例如叶绿体DNA分子较小，可以用质粒构建叶绿体DNA文库。质粒载体可用于