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Real-time PCR 技术 2008-12-19 引 言 由于传统的PCR技术只能对基因作定性的分析；也就是只针对特定基因做出有或无的判断，无法精确的定量出所表达的基因数量，使得研究和诊断中，有关量化的问题始终无法获得解决。于是研发出 〝实时定量PCR〞 —— Real-time PCR. 主 要 内 容 第一节 Real –time PCR 技术的基本原理 第二节 Real –time PCR 常用探针的介绍 第三节 Real –time PCR 技术的应用 溴化乙锭（EB）法 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，可以嵌入碱基分子中，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。 探 针 法 基于荧光共振能量转移原理 Fluorescence Resonance ?Energy Transfer (FRET) 基本原理小结 在 PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如： SYBR GREEN I ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数： CT 值（ Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的 CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。 Taqman探针优缺点 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 医疗方面 病原体检测 基因病诊断 监控药物和疗法的治疗效果 食品及环境领域 致病菌检测 转基因生物检测 环境微生物的检测 分子生物学中的应用 基因转录检测 例如，比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异，如药物处理、物理处理、化学处理等 特定基因在不同时期的表达差异 RNAi基因失活率的检测 遗传学中的应用 SNP基因型分析 等位基因分析 甲基化分析 变 性 常用探针 产生非特异性荧光 不能检测到640nm波长的荧光 复 性 常用探针 发出荧光 二甲氨基偶氮苯甲酚 (DABCYL) 1-氨基蔡-8-叛酸（EDANS) 常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。 延 伸 没有荧光 常用探针 分子信标探针优缺点 优 点 缺 点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 常用探针 双杂交探针 常用探针 由两条相邻探针组成 在一条探针的5’ 端标记FAM荧光基团 另一条探针的3’端标记Red640荧光基团 Roche LightCycler 双杂交探针 常用探针 基本原理 变性 退火 无荧光 有荧光 延伸 无荧光 常用探针 常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。 双杂交探针的优缺点 优 点 缺 点 高特异性：两个不同探针 淬灭效率高 探针影响扩增效率 探针较长，合成成本相对较高 常用探针 第三节 Real –time PCR 技术的应用 应用 医疗方面 应用 临床检测： 疾病的临床早期诊断 1. 如各种肝炎、性病、遗传性疾病 、与优生优育相关的疾病以及结核病等等 2. 医院、血站及防疫站的确诊 病原体含量分析 疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方法 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导 HLA分型：取代传统电泳方法 遗传病诊断： 医疗方面（2） 应用 等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测 肿瘤诊断: 肿瘤相关基因表达的检测 包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因 肿瘤标志物 如癌胚抗原、同工酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 肿瘤耐药基因 医疗方面（3） 应用 药物相关： 新药开发研究 超早期感染用药物及疗法的研究与开发 药物疗效研究 合理用药 个人基因型与药物疗效之间的关系 应用 应用 * 刘 娜 第一节 Real –time PCR 技术的基本原理 Real –time PCR 技术的数学原理 Real –time PCR 技术的化学原理 数学原理 基本原理 Real –time PCR 技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。 Real –time PCR 技术的数学原理 基本原理 Ct Ct 荧光信号强度 模板浓度的log值 阈值 基本原理 扩增曲线 荧光信号强度 指数期 平台期 线性期 基线期 阈 值 一般这个阈值是以