微生物(酵母)的培养基优化18747.docVIP

实验一 微生物(酵母)的培养基优化 (指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰) 一．实验目的： 掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三．仪器与试剂 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。 四．实验方法 (1)、培养基的配制(见表1,2) 表1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案 编号 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD） 0h? 12h 24h 36h 48h 60h 1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121℃下灭菌30 min，冷却。 （3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。 （4）测OD值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长? 实验二 紫外线的诱变育种 (指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰) 一．目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三．菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤 （1）菌悬液的制备 （a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 （2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 　　（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 　　（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 　　(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。 　　(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 　　(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 (8)观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内