微生物的研究进展chapter2-3 微生物基因组学的研究进展.ppt

1、基因组测序及数据处理 ⑴ DNA测序的一般方法 ⑵ 序列的组装 ⑴ DNA测序的一般方法 链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序 ① 链终止法测序 (the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 ② 化学降解法测序 基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解. 技术路线 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 ③ 自动化测序 基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. ④ 非常规测序 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. ⑵ 序列的组装 ① 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. Shotgun法序列拼接 实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装 超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化 ↓ 构建到质粒载体中 ↓ 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp ↓ 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓ 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ↓ ↓ ② 限制测序 限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺序进行组装. 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法. 如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同. ③ 指导测序与序列组装 建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”, 即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。 两种策略的比较 鸟枪法策略 指导测序策略 不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 时间短 需要几年的时间 需要大型计算机 得到的是草图(Draft)