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驱动蛋白头部与微管结合状态的直接观察 作者：Nicholas R. Guydosh Steven M. Block 摘要： 二聚化的马达驱动蛋白1将ATP水解转换成化学能用来完成沿微管运输货物的机械工作。货物附加在8nm的双马达域，增量的驱动蛋白秸秆移动过程中进行不对称的“移交手”式步行。个别头部与微管相互作用的程度在加强，但是，仍存在着争议。一直限制实验的进展主要是由于缺乏一个在头部附件微管运动的检测方式，因此需要采用间接的方式。在这里，我们报告了一个单分子检测，可直接报告头部驱动蛋白分子结合行走，并且表明只有一个头在低浓度的ATP中和微管进行结合的。一个珠状物通过短的DNA系带和两个驱动蛋白中的一个驱动蛋白头结合，并应用迅速交替妨碍和协助光学陷阱负载的手段，前面和珠向后移动之间的时间，两个离散值交替期间加强，在这些间隔相应联系时，头部采用了绑定或绑定状态。只有当其与ATP结合，链接的头才能重新绑定微管。 光俘获的驱动蛋白化验通常涉及跟踪和装载附加在其自然货运场所到蛋白质的共同秸秆羧基端。由于珠隶属秸秆往往报告整个分子，由两个独立的头部产生的位移仍然没有得到解决。单分子荧光技术已成功地解决了这些荧光标记分子头部，但这种方法时空分辨率有限，缺乏控制能力，适用于负载，可用于探测头部和微管之间的结合。 我们克服了这些直接被困的光珠与两个头部之一连接的限制，而不是柄（图1a），没有丧失分子的马达功能。一个双链DNA低聚物（70个碱基对的底物）是连接到一个精心设计的半胱氨酸残基对（N62C）上的“二聚体”马达结构域，它的另一端是连接到一个链霉涂层珠。因为这短暂的低聚物衬托时间不长，系绳是硬的，直接传输到头部珠。对照实验，其中珠是附在一个低聚物柄相连结构，显示马达仍然在8 nm增量加强（补充图1）。随着珠和两个头部之一连接在一起，便卸下，马达行驶980 ± 80nm的平均距离（mean±s.e.m.），然后分离（补充图2），这个过程显示了相当于未标记的驱动蛋白。值得注意的是，在这种情况下珠联合的发动机卸载速度平均为581 ± 9nm秒（mean±s.e.m.），这相当于野生型马达记录（补充图3）卸载速度。当头部联合珠遭到阻碍受力载荷钳位条件下，我们观察到以16.3 ± 0.1nm的步伐向微管（+）极（图1b和补充图4a）移动，完全按照预期的执行与8.2nm微管蛋白二聚体间移交手步行沿原丝的移动。当主力减少了一半时，负载被应用于一个单一的头部，而不是柄（由高处?6pN到?3pN），这符合高效的电机效率受头部连锁的影响，因为一半的负荷转移通过每次两步距（补充图3）。 当头部联珠遭到协助负荷，我们发现了一个由一个“超速”的运动（?前23nm）和紧接着的“恢复”运动（?后7nm）组成突然的16nm的前进运动（图1 c和补充图4 b）。超速和恢复运动之后的持续时间间隔对ATP浓度敏感，当ATP浓度降低时，这两个时间增加（图1d和补充图5）。此属性表明，ATP的汽车必须都在超速和恢复时间间隔间绑定。我们还发现，头部位置方差联珠的高比在复苏期间，过冲，这意味着更多的情况是进入珠之间的联系与微管期间介绍过冲（参考图6）。由于它们的小振幅，议案的恢复部分人误解了我们的脚步调查程序，造成了超速和恢复一些对运动显示为单一的16nm的过渡。 珠和头部联合的协助负荷运动的原因可能是下面的模型（图1e）的，这是既定的驱动蛋白生化反应周期是一致的。在ATP结合的微管的约束，相关负责（状态1）触发其绑定的合作伙伴负责推动和重新绑定到微管（状态2）。 （ATP结合和头部运动代表独立的步骤，但伴随简单的显示。）联系头部然后释放微管和行动之前，它的绑定合作伙伴（状态3）。在这种情况下，加载应用程序的帮助，不仅有助于拉这头前锋，而且还提供一个小扭矩，颈部连接器之间的域生成（加入团长柄）和DNA的附着点。为了减轻扭矩，链接的头部旋转向后采取面向方向，自由的微冲在务虚。颈部连接器区域由一个单一的多肽链（?13残基），可以作为一个自由旋转。随后的三磷酸腺苷结合的微管行头可以自由的头部重新绑定到其正确的方向和释放ADP公司（状态4）微管。最后，水解ATP的后脑，释放皮（无机磷），并从微取消绑定再生的开始配置（状态1），但与分子由16.4nm（两个步骤）先进。一个冲的存在意味着，驱动蛋白采用了一个头方向（1 -HB）等待ATP的连续8之间，其茎nm进步的状态。此外，在ATP的停留时间过冲依赖表明，未绑定的头部不能诱导重新绑定到简单地哄微管在其与光学陷阱合作伙伴方面有：一些额外的要求必须得到满足。 如果采用1-HB之间的茎进程的进展，在前面的讨论暗示，那么应该可以自由摆动，头向后联系，以及对合作伙伴的约束扭转转发的载荷方向。为了检验这种预测，我们修改我们的力量钳设备切换之间的阻碍，并协