第三代腺病毒载体重组构建优化.docVIP

第三代腺病毒载体重组构建的优化【摘 要】 第三代腺病毒载体以其高容量、长时间转基因表达及低毒性和低免疫原性的优点已经广泛应用于基因治疗中， 目前这种病毒载体的重组构建已经有许多优化和改进。 【关键词】 第三代腺病毒；重组构建；优化 随着腺病毒载体的研发深入第三代腺病毒载体已经克服了前两代的一些不足， 以其高容量、能够长时间转基因表达以及低毒性和低免疫原性的优点被广泛应用于基因治疗的研究。重组构建第三代腺病毒载体费工费时大规模生产为了改变这种状况近年来已经研发出许多优化的方案， 本文就此予以综述。 腺病毒的基本结构 腺病毒是无包膜病毒， 它的基因组为线形双链DNA， 长度约为36 kb， 被一个二十面体的蛋白质外壳所包裹。腺病毒基因组有编码区和非编码区两部分。在编码区根据DNA复制周期的不同分为早期基因区和晚期基因区， 前者有E1～E4区， 主要编码病毒的调节蛋白后者分为L1～L5五个区， 编码病毒的结构蛋白早期表达的调节蛋白可以调控晚期基因的表达。最先表达的是E1基因， 它所表达的蛋白(包括E2产物) 是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的， 但其对细胞的毒性也很强。在非编码区， 腺病毒双侧末端各含有一小段约100bp的末端反向重复序列(ITR)。ITR含有病毒进行复制和包装所必需的顺式作用元件及DNA复制起始点， 它是病毒DNA复制所必需的， 其内侧为病毒包装信号(ψ)图1。 前两代腺病毒载体的重组构建 第一代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和(或)E3区而获得(图1)。它可以插入6.5kb的外源基因， 去除E1阻止了依赖E1和E2区功能蛋白的转录和随后病毒DNA 复制及病毒壳体蛋白的产生但是其增殖必须在能够反式提供E1区表达蛋白的感受态细胞中完成。目前可以提供E1区表达产物的细胞株有：293，911，N52.E6和PER.C6。第一代腺病毒载体的优点有：在体外的生产效价很高易感的宿主细胞范围广病毒基因组整合于细胞染色体外可以避免插入诱变的可能。然而尽管这种腺病毒载体不能在活体内复制，但由于许多感受态细胞都含有允许E2基因表达的E1样蛋白， 即使其表达量很低， 仍可增强病毒DNA 复制、晚期结构蛋白合成及可复制腺病毒(RCA)的产生，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对受感染细胞的免疫反应，从而最终导致转导细胞被消除， 使治疗基因表达失败[2]。 为解决第一代病毒载体生产中出现的问题，并提高插入基因，根据RCA 的产生机制，如腺病毒载体有多处缺失可以降低RCA出现机率，减少宿主的免疫反应性，利于载体的长期和重复应用， 研究者将不同的早期基因如E1±E3或E2/E4去除，研制生成第二代腺病毒载体(图1)，构建出E1±E3和E4 区双缺失载体(ΔE1ΔE4)以及E1±E3和E2区双缺失载体(ΔE1ΔE2)[3]。由于早期基因区的缺失，载体便可容纳14kb的基因序列，扩大了载体的克隆能力。然而与第一代腺病毒载体相比，第二代腺病毒仍然不能避免残余病毒基因表达物在体内的免疫反应和细胞毒性，并且它从头合成蛋白的能力也会受到抑制。不过ΔE1ΔE2 载体延长了基因的表达时间[4]。 第三代腺病毒，也称为裸腺病毒(Gutless adenovirus)。由于它去除了所有病毒编码基因，仅保留了5’和3’末端反向重复序列(ITR)与野生型腺病毒的包装信号(ψ)(图1)，需要辅助病毒提供编码序列，所以也称辅助病毒依赖性腺病毒(helper-dependent adenoviral vectors)。因为其具有可以容纳36kbDNA的超大容量，也有人将其称为高容量腺病毒(High-Capacity Gutless Adenoviral Vectors)。 重组构建第三代腺病毒载体需要三个部分，分别是第三代腺病毒载体(构建携带目的基因载体的成分)，辅助病毒(反式提供病毒复制包装等功能)和感受态细胞株(病毒包装的场所)。由于载体壳体的包装仅仅需要整个腺病毒基因组的75-105%即可完成，而作为治疗表达基因的壳体通常不到36kb，所以为了完成基因组大小的壳体化，还必须借助填充片段DNA(stuffer DNA)。最初stuffer DNA被认为只参与了病毒基因载体的包装，主要有λ-噬菌体、酵母、细菌和非人源DNA[5]。目前研究发现使用包含基质附着区(MAR)元素的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(HPRT)内含子序列作为stuffer DNA可以提高DNA的稳定性，且不会引起免疫反应，并且MAR还可使腺病毒基因组稳定进入细胞核，从而延长基因的表达时间，所以值得推荐[6]。 由于第三代腺病毒去除了所有编码基因和基因组复制所需的蛋白，所以壳体的生成和包装均需反向提供。这就需要第三代腺病毒与辅助病毒同时感染，但由于辅助病毒和第三代腺病毒具有相同