鱼类培育细胞抗病毒基因差减cdna 文库的构建.pdfVIP

维普资讯 第 27卷 第 2期 水 生 生 物 学 报 Vo1．27．No．2 2003年 3月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Mar ．，2003 鱼类培养细胞抗病毒基因差减 cDNA文库的构建 张义兵 石耀华 桂建芳 (中国科学院水生生物研究所 ；淡水生态与生物技术 国家重点实验室 ，武汉 430072) 摘要 ：紫外线灭活的草鱼出血病病毒 (GCHV)能诱导鲫囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度 的干扰素 ，从而诱导宿主细 胞基 因表达 的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞 mRNA，利用抑制性差减杂交 技术 ，成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基 因差减 cDNA文库 。以鲫管家基因a—tubulin和 ~actin作为差减指标 ，检测 差减 cDNA文库的差减效率分别高达 2 和 2倍 ，表明经过病毒诱导后的细胞中，某些差异表达基因的富集效率也 接近 2倍 。鱼类抗病毒基 因差减 cDNA文库 的建立对快速分离、克隆鱼类抗病毒相关基 因和认识鱼类细胞抗病毒 免疫 的分子机理有重要意义 。 关键词 ：鱼类 ；草鱼 出血病病毒 ；抗病毒相关基 因；诱导 ；抑制性差减杂交 中图分类号 ：$941．41 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3207(2003)02—0113—006 鱼类病毒病是严重影 响当今世界水产养殖产量 疫反应 的基因或抗病毒基 因，丰富鱼类抗病毒免疫 的主要制约因素之一 。长期 以来对鱼类病毒病仍无 机理的认识 ，而且克隆 的抗病毒基 因可 以直接应用 有效的防治方法 ，较为成功的是使用疫苗 。 目前能 于鱼类基 因工程的抗病毒育种探索 。本文报道运用 够用于养殖的病毒疫苗极为有 限，而且某些疫苗虽 SSH技术建立鱼类抗病毒基因差减 cDNA文库 的结 能有效控制病毒病 ，但仍然不能彻底根治鱼类病毒 果 。 病 的危害…。使用疫苗除费时、费力 ，不适于大面积 1 材料与方法 水面养殖外 ，还可能 由于病毒抗原漂移和新毒株的 出现 、以及母源抗体 的干扰等原 因导致疫苗接种失 1．1 细胞与病毒 鲫囊胚细胞系(Blastulaeembry 败 1 。而分离鱼类 自身抗病毒基 因、构建转基因 onicceilsofcruciancarp，CAB)由本实验室建立_9j，草 鱼 ，可能是彻底解决鱼类病毒病的最为理想途径。 鱼肾细胞 系 [Kidneyofgrasscarp(Ctenopharyngodon 然而 ，在 鱼类 目前不仅没有得到有效 的抗病毒 idellus)，CIK]由中国水产科学院长江水产研究所建 基因，而且对鱼类感染病原后 的免疫机制也缺乏 了 立L1。。。细胞用 10％新生牛血清 (杭州 四季青产 品， 解和认识…。抑制性差减杂交 (SuppressionSubtrac． 使用时 56cI=灭活 30min)的TC．199(GIBCO产 品)培 tiveHybridzation，SSH)技术常用于快速分离和克隆差 养基置 28cI=培养_9j。草鱼 出血病病毒 (Grasscarp 异表达基因 _-5J。近年来 的研究表明，紫外线灭活 hemorrhagevirus，GCHV)…j在 CIK细胞上扩增并检 的草鱼 出血病病毒能诱导多种鲤科鱼类培养细胞高 测病毒滴度。 效表达干扰素 (Interferon，IFN)_6j，粗制鲫干扰素对 1．2 GCHV紫外线照射灭活 CAB细胞干扰素用紫 草鱼出血病有较好的防治作用_7J。同哺乳类 TypeI 外线灭活的GCHV诱导，采用本实验室的灭