用于提高转基因艾美耳球虫筛选效率的双框表达载体的构建.docVIP

  用于提高转基因艾美耳球虫筛选效率的双 框表达载体的构建# 汤新明，秦梅，索静霞，陶鸽如，闫鑫磊，刘贤勇，索勋** 5 10 15 20 25 30 （中国农业大学动物医学院，北京 100193） 摘要：目的：构建同时表达筛选基因和目的基因的双表达框载体时，在筛选框中加入药物抗 性基因，以提高转基因球虫的筛选效率。方法：利用 PCR 的方法从本实验室已有的质粒中 扩增乙胺嘧啶抗性基因（DHFR-Ts）和加强型黄色荧光蛋白基因（EYFP），然后利用搭桥 PCR 的方法将上述两片段进行融合，获得融合筛选基因（DHFR-TsEYFP, DE），用其替换 质粒 pHEEAAssRA 中的 EYFP2 基因后得到双框表达载体（pHDEAAssRA）。SnaBI 内切酶 线性化该载体后，利用核转染的方式转染弓形虫以对其功能进行验证。结果：转染后不同时 间均可检测到表达黄色荧光蛋白的弓形虫；在乙胺嘧啶药物压力下，发光率逐渐上升。结论： 构建的双框载体可在弓形虫体内工作，为其在转基因艾美耳球虫中的应用奠定了基础。 关键词：艾美耳球虫；乙胺嘧啶；真核表达载体；功能验证 中图分类号：S855.9 Construction of the double-cassette vector for improving the selection efficiency of transgenic Eimeria spp. TANG Xinming, QIN Mei, SUO Jingxia, TAO Geru, YAN Xinlei, LIU Xianyong, SUO Xun (College of Veterinary Medicine,China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: Objective: To imporve the selection efficiency of transgenic Eimeria, a double-cassette vector containing pyrimethmine resistance gene (DHFR-Ts) and enhanced yellow fluorescence protein gene (EYFP) was constructed. Method: Expression plasmid pHDEAAssRA was construccted by replacing the EYFP2 coding fragment with fused DHFR-Ts-EYFP (DE) gene. The linearized pHDEAAssRA was transfected into tachyzoites of Toxoplasma gondii via nucleofector transfection. From 18 h post transfection, pyrimethmine (1 um/ml) was added into the culture. Results: Tachyzoites expressing yellow fluorescent protein were observed at 12 h post transfection, indicating the scuccess of this construct. Moreover, the fluorescent rate increased over time after pyrimethmine was added. Conclusion: The fused DHFR-Ts gene is functional in Toxoplasma gondii, encouraging the accelaration of the process by drug selection in Eimeria spp. transfection. Key words: Eimeria species; DHFR-Ts; Pyrimethmine; Eukaryotic expression vector 35 0 引言 自 1998 年英国 Tomley 研究小组发表第一篇关于艾美耳球虫转染的研究论文以来[1]，球 虫转基因研究领域取得了一系列突破性进展。先后实现了柔嫩艾美耳球虫的瞬时转染、稳定 转染及报告基因的转基因表达[2,3]。基于球虫的生物学特性，索勋于 2002 年首次提出转基因 40 球虫作为疫苗载体的设想，实现该设想首先需要突破的技术瓶颈在于如何实现报告基因和病 原抗原基因的同时表达。目前，有两种策略可以解决这一