猪圆环病毒研究进展.pptVIP

猪圆环病毒研究概况 芦银华 陈溥言 南京农业大学动物医学院 1、猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）概况 2、PCV复合PCR方法的建立及初步应用 3、PCV2毒株的分离及鉴定 4、PCV2全基因组的克隆及序列分析 5、PCV2分子克隆化病毒的构建 6、PCV2主要结构蛋白基因（ORF2）的克隆与真核表达 7、PCV2单克隆抗体的研制 PCV-1、2基本情况 1、PCV-1基因组全长1，759bp，PCV-2为1，768bp；基因组核苷酸序列同源性仅为68%-75%。 2、PCV-1、2都主要包含ORF1、ORF2两个阅读框；ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2编码病毒的核衣壳蛋白，具有良好的免疫原性。 3、PCV-1无致病性，广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中；PCV-2现证明与断奶仔猪多系统消耗综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）及A2型先天性综合征相关。 PCV致病性及危害 1、PCV可在猪源细胞培养物上繁殖，不产生CPE，易被忽视，因此对猪源细胞疫苗或诊断抗原生产造成潜在的危害。 2、PCV-2多数情况下引起亚临床感染，但如与其他病原如PPV等混合感染或环境应激情况下则可直接发生PMWS。 3、PCV-2的靶细胞 为淋巴细胞，主要是B细胞，病毒感染后引起细胞凋亡，使机体免疫抵抗力下降，从而继发感染其他病原体，包括PRRSV、猪链球菌等，引起更严重的疾病。 研究目的 1、建立一套完整的便于实际推广应用的检测PCV感染的方法，如PCR、IFA及ELISA方法等。 2、用建立的方法对我国主要养猪省份进行PCV的流行病学调查，以便提出有效的综合防治措施； 二、复合PCR方法的建立 1、引物设计 引物1（为PCV-1、2共同序列）： 5’-CCGCGGTGGCTGAACTT-3’（PCV-1 nt478-496；PCV-2 nt491-519）； 引物2（PCV-1特异序列）： 5’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3’（PCV-1 nt1108-1129）； 引物3（PCV-2特异序列）： 5’-ACCCCCGCCACCGTTACC-3’（PCV-2 nt1627-1644） 引物1、2扩增的片段长度为652bp，引物1、3之间的跨幅为1154bp。 2、复合PCR方法的初步应用 1）对多株猪源传代细胞（包括4株PK-15及1株ST细胞）进行了PCV检测，发现所有细胞均污染有PCV-1，其中一株还扩增出了PCV-2基因片段； 2）对38个病例（病猪表现为消瘦、呼吸困难及淋巴结肿大等）的组织（取肺）进行PCR扩增。结果发现，9个病例同时存在PCV两种血清型病毒感染，23个病例感染有PCV-2 。部分电泳结果见下图。 三、PCV-2毒株的分离鉴定 病料处理（将PCR扩增阳性的组织病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒，如PRRSV） 接种细胞—PK-15盲传10代（300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理） 间接免疫荧光实验及电镜观察病毒颗粒 超薄切片观察结果（30，000×） 四、PCV2毒株全基因组克隆及序列分析 1、DNAstar分析表明，PCV2全基因组1.768kb含有单一的EcoRI酶切位点。利用这一特点，上下游引物中都设计了EcoRI位点（-GAATTC-），以便于全基因组的体外操作。 引物1：5’-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3’ 引物2：5’-ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3’ 2、PCR产物的克隆 五、PCV2分子克隆化病毒的构建 六、猪圆环病毒2型 ORF2基因的克隆及其表达 七、PCV2单克隆抗体的研制 1、病毒初提：终浓度6%-8%的PEG6000。 2、免疫BALB/c小鼠：采用长程免疫，最后一次免疫后3天取脾细胞与sp2/0融合。 3、间接免疫荧光试验（IFA）检测 4、共获得2株杂交瘤细胞。 5、现正在进行各种特性鉴定 小结 本实验建立的复合PCR方法具有良好的特异性，可用于PCV的检测、分型及相关疾病的诊断。 从实验结果可以看出，发病猪群中广泛存在PCV感染，而且主要的血清型为PCV-2。而且许多实验室保存或正在使用的PK-15或ST细胞均存在PCV污染，净化猪源细胞势在必行。 分离鉴定了5株PCV-2，并测得其全基因组，序列分析表明，分离株来源不尽相同，其中3株PCV-2与美国一分离毒株同源性很高，亲缘关系密切，另外2株则与一德国分离株亲缘关系很近。 分子克隆化病毒的构建为获得纯的PCV2病毒及进行PCV2致病机