泽漆、大戟等内生菌的分离、鉴定及其产物抗病毒活性研究.pptVIP

实验七　内生菌的分离、鉴定 一 、实验的目 本实验以植物组织为材料从中分离内生菌，其目的是筛选活性内生菌菌株，掌握鉴定种类、液体培养、次生代谢产物提取和活性测定的方法，为生物防治提供优良菌株材料。 植物内生菌次生代谢产物的多样性为人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制，利用植物内生菌工业发酵生产重要的药物开辟了新途径，具有极大的应用价值和开发潜力。 二、实验原理 本实验采用组织块法和组织悬液稀释法分离内生菌，通过改良的培养基筛选内生真菌，其中部分内生真菌能够产生与宿主相同或相似的药用活性成分。 内生菌系统地分布于植物体根、茎、叶、花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙。内生真菌（endophytic fungi）菌丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中含量极少。 三、实验材料 1. 植物 黄瓜(Cucumis sativus) 、甘蓝(Brassica0leracea)、百慕大草(Bermuda grass)的茎、小麦、番茄、辣椒、油菜、杂草，花生(Archis hypogaea)果仁、已从黄瓜、甜菜根、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、棉铃和水稻叶子及其它植物储藏器官内分离到大量内生细菌 。 2. 皿内筛选靶标菌 苹果腐烂病菌、小麦全蚀病菌、油菜菌核病菌、猕猴桃溃疡病菌等30多种真菌和细菌。 3. 生测及防病试验 小麦白粉病、小麦条锈病、小麦纹枯病、油菜菌核病、西葫芦白粉病、苹果腐烂病等。 1. 供试品种 采集不同地区、不同品种的苗期、开花期、 荚果膨大期的无病株和种子。采集新鲜材料后立即使用。 2. 分离培养基 a. 采用牛肉膏蛋白胨固体培养基、肉汁胨培养基(BPA)分离细菌 肉汁胨培养基(BPA)：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂 18.0～20.0 g, 蒸馏水 1000.0 ml。以上不加琼脂即为肉汁胨液体培养基。 b. 采用PDA培养基分离真菌 c采用高氏1号培养基、YCED 培养基、YCED 培养基初筛固体培养基TWYE 培养基YIM-2 培养基HVA 培养基分离放线菌。初筛培养基抑制剂浓度为每L 培养基中含有250U 的链霉素和50mg 的重铬酸钾。 材料与方法 1 内生菌的分离与纯化 1.1 供试材料 供试植物：采集于陕西不同地区处于生长期的泽漆健康植株。 供试培养基： （1）牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水 1000mL，琼脂15g，pH 7.2～7.4）； （2）PDA 培养基（葡萄糖 20g，马铃薯 200g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL）； （3）高氏 1 号培养基（可溶性淀粉 20g，KNO3 1.0g ，K2HPO4 0.5g ，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水 1000mL，琼脂 15g，pH 7.2～7.4）。 分别用于内生细菌、内生真菌和内生放线菌的分离培养。 1.2 分离与纯化 真菌采用组织分离法，细菌及放线菌采用稀释涂抹法进行分离，分离出后挑取形态颜色相似的菌落，纯化后于斜面中保存备用。 1.2.1 实验准备 培养皿清洗，包皿；培养基配制，分装 灭菌：干热灭菌（160℃～170℃，1～2h，不能超过180℃）包括：培养皿，研钵，石英砂，滤纸等； 高压蒸汽灭菌（0.1Mpa,121℃,30min）包括：培养基，无菌水，移液枪枪头 倒平板：遵循稳，轻，快原则倒皿，置于28℃条件下培养三天，无菌生长方可使用 材料采集：选择健康泽漆，带根挖出； 采集地点为西北农林科技大学作物标本区 1.2.2 内生菌分离 分离真菌：取健康泽漆茎、叶、花、根的组织，自来水冲洗干净后用75％酒精漂洗4分钟，再用6～10％的次氯酸钠漂洗合适的时间，最后用无菌水冲洗4次。在超净工作台上将叶切割成约0.5cm×0.5cm的小块，茎和根切成0.5cm的小段，分别置于PDA培养基平板上（花不用切割），24-26℃下避光培养。第四次无菌水涂抹平板做对照。3－7天后，可见断面边缘长出菌丝。若相应对照无污染，则可挑取前端菌丝转入分离培养基。采用此方法，不断对分离得到的菌株进行纯化，纯化好后保存在斜面中。 分离细菌及放线菌：将无菌处理的泽漆茎、叶、花、根样品各1.5g，每样品加10ml 无菌水碾碎静置15min 后,各取80μl涂在牛肉蛋白胨培养基、高氏一号培养基平板上,同上第四次无菌水涂抹平板做对照。27 ℃黑暗培养,细菌培养3～7天后，放