液相色谱法简介及色谱方法-深圳云帆兴烨.pdfVIP

深圳云帆兴烨科技有限公司 液相色谱法简介 气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯 物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属 盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。 在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色 谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几 十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办 法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流 动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了 细小（10?m）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压 降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1~10mL/min。 从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏 度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、 高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经 典液相色谱。 高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和 液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。 高效液相色谱所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高 度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与 速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议 程H=A+B/?+C?。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由 于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩 散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可 知，气相色谱（GC）的流动相流速u 增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液 相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱 也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响 也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选 择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样 品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免 带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测 产生干扰作用。 高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气 相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提 高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合 物结构提供纯样品。 由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大 于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总 数的75~80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合 物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的 分离和分析。 但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不 如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相 色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。 1．分离原理 深圳云帆兴烨科技有限公司 凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作 用也不同而进行分离、分析的方法。 凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛 大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱 后，不同大小的样品分子（图14—2中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图14—2中以空 心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻， 因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作 用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动