黄瓜硝酸还原酶基因（CsNR）正反义表达载体的构建.docVIP

 黄瓜硝酸还原酶基因（CsNR）正反义表达 载体的构建# * 5 10 15 20 25 30 35 40  摘要：采用 RT-PCR 方法，从黄瓜幼叶中克隆获得硝酸还原酶基因 CDS 全长和片段（CsNR; EC 1.6.6.1），其中 CDS 全长 2748 bp，编码 915 个氨基酸；CDS 片段 360 bp。CDS 全长和 pROK经 KpnI 单酶切和连接，构建 CsNR 的正义表达载体。CDS 片段和 pROK经 KpnI 和 SacI 双酶切，构建 CsNR 的反义表达载体。 关键词：黄瓜；硝酸还原酶；正义表达载体；反义表达载体 中图分类号：S642.2 Construction of Sense and Antisense Expressing Vector of Cucumber Nitrate Reductase (CsNR) PAN Lingling1, LI Qiang1, WANG Xiufeng1,2, YANG Fengjuan1,2 (1. College of Horticulture Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian Shandong 271018; 2. State Key Laboratory of Crop Science,Taian Shandong 271018) Abstract: A fragment and fulllength CDS of cucumber nitrate reductase (CsNR; EC 1.6.6.1) was isolated from cucumber young leaves (Cucumis sativus L.) by RT-PCR, respectively. The fragment and full-length CDS is 2952 and 360 bp, respectively. The full-length CDS and pROKII were digested to construct sense expressing vector. The fragment CDS and pROKII were digested to construct sense expressing vector. Key words: Cucumis satinus L.; nitrate reduatase; sense expressing vector ; antisense expression vector 0 引言 植物硝酸还原酶是氮同化代谢的关键酶和限速酶，它以 NAD（P）H 为电子供体催化硝 酸盐的还原，生成亚硝酸盐。首先，硝酸盐通过谷氨酸合成循环转变为铵，分别由胞质中的 硝酸还原酶以及叶片叶绿体中的亚硝酸还原酶催化[1]。硝酸还原酶催化硝酸盐还原成亚硝酸 盐是植物整个硝酸盐同化过程中的限速和关键酶作用步骤[2-4]。对高等植物而言，研究发现 硝酸盐是调节硝酸还原酶活性[5]以及 NR 表达[6]的主要因子。故硝酸还原酶被认为是硝酸盐 同化过程中的限速酶和诱导酶[7,8]，那么植物中的硝酸还原酶活性和 NO3- 含量之间就应该存 在着密切联系[9]。现已从大麦[10]、笋瓜[11]、烟草[12,13]、拟南芥[14,15]、番茄[16]、玉米[17]和大 白菜[18]等多种植物种类中克隆出了多种 NR 基因。目前，人们在植物的盐胁迫信号转导机制 方面已取得了大量成就[19]，但均以 NaCl 作为处理手段。 黄瓜作为主要的设施蔬菜作物之一，在设施栽培中，人们为了高产，盲目施用大量氮肥； 加之设施环境地温高、蒸发量大、无雨水淋洗及连作等不合理的栽培方式，导致土壤发生次 -1-  生盐渍化[20]。温室土壤的盐分组成特点和滨海、内陆盐土不同，其阴离子主要是 NO3-，占 阴离子总量的 67%-76%，阳离子则以 Ca2+和 K+为主[21]。而过量 NO3–胁迫下，黄瓜 NR 表达 水平以及 NRA 活性的变化尚未见报道。本试验在前人研究的基础上，通过克隆黄瓜硝酸还 原酶基因全长和片段，构建其正义和反义表达载体，为硝酸还原酶在黄瓜抗性育种中的应用 45 提供一定的理论依据和实践途径。 1 材料与方法 1.1  试验材料 以‘津优 35 号’黄瓜品种为试材。 大肠杆菌 E.coli DH5α 、表达载体 pROKⅡ由本实验室保存。pMD18-T 载体、Kpn、 50 Sac等购自大连宝生物公司。Tap DNA 聚合酶、快速琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒 小提试剂盒等购自北京康为世纪生物科技有