恶性疟原虫AMA1胞外域在家蚕生物反应器中的表达与纯化.docVIP

 恶性疟原虫 AMA1 胞外域在家蚕生物反应 器中的表达与纯化# 申俊1,2，吴昕昕1,2，陈剑清1,2，张耀洲1,2** 5 10 15 20 25 30 35 40 45 （1. 浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018； 2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457） 摘要：恶性疟原虫 AMA1 是理想的疟疾疫苗候选抗原，其胞外域具有良好的免疫原性，可诱 导机体产生中和抗体，用于疟疾疫苗的制备。本文以恶性疟原虫 3D7 标准株 cDNA 为模板， PCR 扩增获得恶性疟原虫 AMA1 胞外域的 ORF 序列，构建 pET32a-AMA1 原核表达载体，转化 大肠杆菌 BL21（DE3）表达融合蛋白，亲和层析纯化后免疫新西兰雄兔获得检测抗体。同时 构建含 His-tag 的 pFastBacHTb-AMA1 转移载体，转化 DH10 Bac 感受态细胞，通过转座获得 含有目的基因的重组 Bacmid，获得的 Bacmid-AMA1 转染家蚕 BmN 细胞，在细胞中经装配形 成重组杆状病毒 vBmAMA1，并复制扩增，用第三代 vBmAMA1 以中等感染复数接种家蚕五龄幼 虫和蚕蛹。Western blotting 鉴定重组蛋白在幼虫和蚕蛹中均得到表达，且重组蛋白分布 于上清液中，便于进一步分离纯化。然后以发病蚕蛹为原料，经匀浆、分级离心、超滤初步 分离后进行镍柱亲和层析纯化重组蛋白，获得的重组蛋白含量高达 126.5mg/kg 蚕蛹。本研 究证实了家蚕生物反应器可高效表达 AMA1 胞外域，具有产量高、成本低，便于纯化等特点， 为大量制备恶性疟原虫抗原蛋白打下基础。 关键词：分子生物学；恶性疟原虫 AMA1 胞外域；重组杆状病毒；家蚕生物反应器 中图分类号：Q78 Expression and Purification of Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen1 Ectodomain in Silkworm Bioreactor Shen Jun1,2, Wu Xinxin2, Chen Jianqing2, Zhang Yaozhou1,2 (1. Institute of Biochemistry, Zhejiang Sci-tech University, HangZhou 310018; 2. TJAB, TianJin 300457) Abstract: Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1(AMA1) is a leading malaria vaccine candidate,its ectodomain with high immunogenicity can induce body produce neutralizing antibody, and has been used to prepare vaccine against malaria.In this paper, PfAMA1 3D7 strain cDNA was used as a template for PCR amplification of PfAMA1 ectodomain open reading frame,the PCR product was cloned into pET32a to constuct expression vector pET32a-AMA1， then recombiant protein was expressed in E.coli BL21 (DE3)and purified by Ni-NTA chelating colum,the purified protein immunize male New Zealand rabbit and the obtained antibody was used for detection.At the same time,the transfer vector pFastBacHTb-AMA1with His-Tag fusion was constucted and transformed into DH10 Bac,transposition with Bacmid,and produced recombinant vector Bacmid-AMA1.Bacmid-AMA1 was transfected into BmN cells to generate recombinant baculovirus vBmAMA1, and copy the amplification, plural vBmAMA1 i