卡波氏肉瘤病毒（KSHV）K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探.docVIP

 卡波氏肉瘤病毒（KSHV）K1 蛋白在血管内 皮细胞中的表达及其功能初探# 5 10 15  摘要：目的：获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒（KSHV）K1 蛋白的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）， 探究 K1 蛋白对 HUVECs 增殖和迁移能力的影响。方法：从本实验室已构建好的含 KSHV K1 基 因 的 重 组 真 核 表 达 质 粒 pCI-neo-K1 中 扩 增 出 K1 基 因 ， 克 隆 入 慢 病 毒 载 体 pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green 中构建重组质粒 pHAGE-K1。利用脂质体将 pHAGE-K1 与包 装质粒 psPAX2 和包膜质粒 pMD2.G 共转染 293T 细胞，收集培养上清经 0.45 μm 滤膜过 滤即获得慢病毒悬液。病毒感染 HUVECs，Western blot 检测 K1 蛋白的表达。通过绿色荧 光蛋白（GFP）流式分选、Western blot 验证获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs。通过细胞增 殖实验和细胞划痕实验检测 K1 蛋白对 HUVECs 增殖和迁移能力的影响。结果：核酸序列测 定证实，克隆的 K1 基因全长 906 bp，与 GenBank 中登记的 K1 基因 100%同源。Western blot 结果显示，含 K1 基因的重组慢病毒感染的 HUVECs 在约 46 kD 处可观察到一特异性条带， 与预期的 K1 蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs 增殖能力与对照组 相比显著增强（P 0.01），细胞迁移能力亦明显增加（P = 0.034）。结论：成功包装了含 KSHV K1 基因的重组慢病毒。KSHV K1 蛋白能够促进 HUVECs 增殖和迁移。 关键词：KSHV K1 蛋白；增殖；迁移 20 Expression of KSHV K1 protein in vascular endothelial cells and preliminary study on its function CHENG Xiaodong, XUE Min, HAO Tingting, QIN Di, LU Chun (Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University, NanJing 210029) 25 30 35 40 Abstract: Objective: To obtain human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) stably expressing KSHV K1 protein and explore the effect of K1 protein on the proliferation and migration ability of HUVECs. Methods: The fragment of K1 gene from expression plasmid pCI-neo-K1 was cloned into the lentivirus vector pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green, then the recombinant plasmid pHAGE-K1, packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G were co-transfected into 293T cells. Culture media were harvested and filtered through a 0.45 μ m filter to remove the cells. The expression of K1 protein in recombinant lentivirus-infected HUVECs was detected by Western blot. Next, HUVECs stably expressing KSHV K1 protein were obtained by flow cytometry assay (FCM) screening and verified the expression of K1 protein by Western blot again. Finally, the effect of K1 protein on the proliferation and migration ability of HUVECs was detected by CCK-8 assay and wound-healing assay. Results: N