Western_Blot操作步骤.docVIP

Western Blot操作步骤 ??一、 Western blot 实验步骤概述??二、 Western blot具体实验步骤???????三、 Western blot 实验注意事项??四、 Western blot关于内参抗体????????????????????一、 Western blot 实验步骤概述1. 组织取材：组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g(约15,000转)15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录????????????????????二、 Western具体实验步骤????Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。????????????????1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)????可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。????????????????2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS凝胶配制????SDS凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS的配方。(2) 样品处理 ????在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用博奥森生产的SDS蛋白上样缓冲液(5X)。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3) 上样与电泳 ????冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。????为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。????电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。????通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。????????????????3.转膜(Transfer) ????我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。????通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。????在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在