激光共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用-上交大《医学实验技术》精品课.pptVIP

激光共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用 上海交通大学医学院 郭强苏副主任技师 激光扫描共聚焦显微镜 激光扫描共聚焦显微镜是80年代逐渐得到广泛应用，比较先进的细胞生物学分析仪器 用激光扫描装置，通过计算机控制和处理获得细胞和组织内部微细结构的荧光图像 观察细胞形态和细胞器及细胞内各种成分的细微变化，并可动态的检测胞内Ca2+、PH值、膜电位等生理信号 激光扫描共聚焦显微镜的发展 激光共聚焦显微镜是经过几十年的不断改进才逐渐发展起来的 1957年马文闵斯基（Marvin Minsky)在美国首先阐明了共聚焦显微镜基本原理，提出了“共轭光路” 1967年埃格尔（Egger)和佩特兰(Patran)成功用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面 1979范德威欧瑞特（Vaader Voort)全面地描述了激光扫描共聚焦显微镜=标准消像差和色差光学透镜+高灵敏度探测器+产生特定波长的功率较大的激光器+高速度大容量的微机系统+精密的扫描装置 激光扫描共聚焦显微镜种类 1、台阶式激光扫描共聚焦显微镜 2、狭缝式激光扫描共聚焦显微镜 3、光束式激光扫描共聚焦显微镜 4、双光子和多光子激光扫描共聚 焦显微镜 激光扫描共聚焦显微镜原理 激光扫描共聚焦显微镜的组成 激光共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的差别 1、光源 普通荧光显微镜 汞灯、卤素灯及其他普通光源 激光共聚焦显微镜 激光（能量大、单色性好） 2、光路 激光共聚焦显微镜 共轭光路（能抑制杂散信号） 3、成像 普通荧光显微镜 照相机、CCD 真彩 激光共聚焦显微镜 PMT（光电倍增管） 伪彩 激光与汞灯的差别 激光 单色性好、能量大 XYZ轴有很高的分辨率 须选择与激光波长匹配的荧光探针 汞灯 激发波长范围广 无Z轴分辨率 荧光探针选择范围广 激光共聚焦显微镜对物镜的要求 消球差——激光共聚焦显微镜图象要求在Z 轴没有偏差 消色差——激光共聚焦显微镜图象很多是 应用不同的波长多通道扫描 温度矫正—激光共聚焦显微镜可以进行活 细胞的动态观察，需调整温度 什么是球差？一个理想的物镜 实际的球镜 无球差时 有球差时 影响显微镜成像质量的因素 物镜（已知的） 浸润的介质(不定的) 不同的介质有不同的折光率，如在23度时物镜油 的折光率是1.515左右 盖玻片(不定的) 玻璃的的折光率是1.5, 但盖玻片的厚度有变化, 因 此要求其厚度控制在0.17mm 标本(不定的) 标本的景深有变化, 其光密度不均匀, 活细胞的折光率从1.33--1.38不等 ZEISS510激光共聚焦显微镜系统的简介 三根激光管、五个波长(351\364\458\488\543nm) 三个荧光通道+一个透射通道 可调控恒温平台 高压汞灯 像差 微分干涉 2.5、5、10、20、40、63、100倍大数值孔径 物镜， 20、40长工作焦距物镜 数字胶片打印机、彩色喷墨打印机、光盘刻入机 激光扫描共聚焦显微镜功能概述 组织光学切片 “细胞CT” 共聚焦成像光路的共轭的原理，可有效抑制同一焦平面上的非测量点的杂散荧光及非焦平面上的荧光，因此具有深度识别能力（最大深度200--400um)，可以逐层获得高分辨率的光学横断面图像，从而对细胞和组织进行无损伤的系列光学切片（Optical sectioning) COS细胞基因表达与鬼笔环肽共定位 大鼠卵细胞的细胞骨架 三维图像重建 激光扫描共聚焦显微镜通过逐层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理软件及三维重建软件获得标本的三维立体结构，从而能灵活、直观地进行形态学观察，并揭示细胞结构的空间关系，测量细胞结构间的空间距离 细胞结构和细胞器测定 激光扫描共聚焦显微镜可进行低光测试、重复性极佳，能进行细胞和组织的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、纺锤体、细胞骨架、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体进行定性定量测定 动脉内皮细胞三标记染色 细胞的有丝分裂（示纺锤体） 荧光的定量定位分析 激光扫描共聚焦显微镜有多个荧光通道和一个透射通道，可对荧光双标记或多标记的细胞和组织进行测试，同时还可以将荧光图像与像差图像重叠以显示荧光在形态结构上精确定位。激光扫描共聚焦显微镜也非常适用于高灵敏度的快速免疫荧光检测如荧光