流式细胞分析术和分选术及其医学生物学应用-瑞金医院精品课件.pptVIP

FLOW CYTOMERTY 简称 FCM FCM技术在国际上已被广泛的应用于 肿瘤 血液病 免疫性疾病 艾滋病 器官移植等方面 的常规临床检查中，并已成为上述疾病诊断、疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计等至关重要、甚至唯一的方法。 近年WHO已公布了全新的血液淋巴组织肿瘤分类标准 见: 美国临床肿瘤协会举办“临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical Oncology，Vo17 No12，1999：PP3835—3849）; 世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册（Springer—Verlay出版社，2000版） 新分类标准将传统的细胞组织形态学和临床特征与现代的免疫表型和遗传变异相整合，比现有的FAB白血病分类方案，多种淋巴瘤分类方案有明显的改进和提高。 目前已在欧美，日本等西方国家中开始逐步采用，成为血液肿瘤的国际标准分类方案。 新的WHO分类标准中 细胞免疫表型分析 主要是依靠 FCM 来检测 LXJ 流式细胞计 填补国内空白 全部采用国产元器件 培养了一批有综合能力的人才 促进了FCM先进技术在各领域应用 1984年在全国率先开设： 研究生课程 《分析细胞学技术》 一、FCM原理仪器结构二、FCM医学生物学应用 FCM细胞大群体的分析?高统计学精度?单细胞多参数相关分析更多、更精确的信息以往其它细胞学技术不可比拟的 （1）FCM数据的存贮 List Mode c.多参数数据的显示、分析 若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。 多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行“设门” ( gating)分析。 可以是单参数设门，也可以是双参数设门。通过设门来调阅其他参数的有关信息。 （一）ＦＣＭ仪器的原理（二）ＦＣＭ样品制备技术 1.单个分散细胞悬液的制备2.选择性分离细胞亚群3.细胞荧光染色技术 1.单个分散细胞悬液的制备 ●酶消化法●机械法●化学试剂处理法 2.选择性分离细胞亚群 3.细胞荧光染色技术 注意:实际工作中?避免使用固定剂?尽可能减少离心和漂洗次数 FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成份是否为特异性结合。　　严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。 在相同的条件下，荧光反应产物的量（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系 一、FCM原理仪器结构二、FCM医学生物学应用 A.百分率计算（细胞群体组成）各种阳性细胞所占的百分含量（%）例如：CD3： 70 %淋巴细胞 CD19：10 %淋巴细胞  在各种生理、病理情况下的变化遵循一定的规律。 B.绝对计数 阳性群体的绝对数量（个细胞/微升）例如：AIDS患者CD4＋50个细胞/ul血; CD34+造血干/祖细胞绝对计数 C.抗原分子表达绝对定量抗体结合数量，若知道抗原与抗体结合的化合价，可以计算出抗原的表达量（个分子/细胞）。例如：败血症患者：264个CD64抗原分子/个中性粒细胞 一、细胞生物学中的应用 (一)细胞动力学中的应用 1. 细胞周期与细胞动力学参数测定 2. 丰富发展对细胞周期的认识 3. 理化因素及药物的细胞动力学作用机理 4. 研究抗肿瘤药物合理使用与配伍方案设计 (二)细胞分化研究 细胞分化过程中同时分析其增殖过程的变化，常常可提供十分重要的信息。 通过检测和定量细胞膜上各种分化抗原。  不同分化阶段的造血细胞 形态有其一定变化 膜分化抗原的不同组合 特殊抗原表达量的变化 （三）细胞凋亡研究 细胞坏死( Necrosis ) 细胞凋亡( Apoptosis ) 细胞凋亡过程中形态学变化细胞生化变化细胞功能改变FCM凋亡检测的基础和依据 二. 细胞遗传学中的应用 流式核型分析( Flow karyotype ) 特定的染色体分选纯化 三. 免疫学中的应用 1. 各种免疫细胞的表型分析 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK淋巴细胞 巨噬细胞 DC等 2. 杂交瘤细胞的筛选与克隆3. 免疫活性细胞功能的测定(1)混合淋巴细胞培养试验( MLC )(2)细胞介导细胞毒试验(3)细胞吞噬功能试验(4)血清中自身免疫抗体的检测(5)细胞因子（cytokines）的分泌能力 四. 肿瘤学中的应用 肿瘤细胞增殖动力学 DNA异倍体细胞群体 异倍体细胞多少 异