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血清谷丙转氨酶活性的测定;二、基本原理 ;生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量,亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较,便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。;;* 仪器
1. 5×15cm试管、刻度吸量管。
2. 恒温水浴、离心机、721型分光光度计。
* 试剂
1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液
⑴0.1mol/L磷酸氢二钠溶液:称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶
解于蒸馏水中,并稀释至1 000ml,4℃保存。
⑵0.1mol/L磷酸二氢钾溶液:称KH2PO413.61g溶解dH2O中,稀释至1000ml,
4℃保存。
⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴,4℃保存。
;2. 标准丙酮酸(含丙酮酸2.0μmol/mL)
取标准丙酮酸钠10mg,用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。
3. ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) 取α-酮戊二酸29.2mg,DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml,在稀释到刻度前,以1mol /L NaOH调pH至7.4(因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降),加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。
4. 2.4二硝基苯肼溶液
取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg,用1mol /L HCl溶于100ml,置棕色瓶中保存。
5. 0.4mol/L NaOH溶液 常规配制。;1、血清样品制备
取鸡血100mL于4oC静置10hr,后经离心分离得到血清,
保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中
高,故应防止溶血;若血清中此酶活性过高,则可适
当稀释后再用) 。
2、标准曲线制作
取6支干燥洁净的试管,按下表操作,得出实验结果。
以吸光度值为纵坐标,酶活力单位数为横坐标,在坐标
纸上绘制标准曲线。
;;3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定
取4支干燥洁净试管,按下表操作(血清和底物溶液
事先保温10min):;五、实验结果 ;1. 在测定SGPT时,应事先将底物、血清在37℃水浴中
保温,然后在血清管中加入底物,准确记时。2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的,超过
500U时,需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于α-L-氨基酸,对D-氨基酸无
作用。实验室多用α-DL-氨基酸(较L-氨基酸
价廉),若用L-氨基酸,则用量减半。4. 溶血标本不宜使用,因血细胞中转氨酶活力较高,
会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。;6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易
变质为多聚丙酮酸,而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不
易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。
7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A,若有
超出,应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本
可增加测定的吸光度,测定这类标本应做血清标本对照管
;* 1个卡门氏单位的定义是:在温度25℃,pH7.4,波长340nm,光径1cm
的条件下,1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。
* 国际单位:在最适温度(25℃)下,1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1
个活性单位,即1IU=1umol/min。
* King法单位定义是:每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min,生
成1μmol丙酮酸称为一个单位。
* Mohun 法单位定义是:每毫升血清在pH=7.4,37℃条件下与底物作用
30 min,每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
;六、临床意义 ;(1)肝胆疾病:
急性病毒性肝炎,ALT是最为敏感的指标之一,会出现明显升高。慢性肝炎血清ALT升高一般不超过参考值的3倍,而且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清ALT可升高至参考值的3-5倍以上。活动型进行性肝硬化时ALT可中轻度升高,但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时,ALT可正常或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时,虽无肝细胞病变,但ALT可稍升高。
(2)其他疾病:
心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使ALT明显升高。骨骼疾病、
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