2014-4-1 上课第一次分子生物学研究方法 (2).ppt

5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件 重组DNA技术 通过体外操作将不同来源的DNA重新组合以获得新功能分子的技术。 用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等。 5.2 基因操作的主要技术 　　　　　5.2.1 DNA分子的切割 （运用限制性内切酶对DNA分子进行切割） 同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，称为同识异切。 同裂酶——同识同切 同裂酶——同识异切 同 尾 酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。 修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键 连接平头双链DNA分子： DNA连接实例 Transform E. coli with recombinant plasmid Kanamycin resistance gene Plasmid pSC101 Tetracycline resistance gene E. coli transformed with recombinant plasmid Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies ??? 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。 5.2.3 细菌转化 5.2.3 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片段的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。 ? 一、基本原理 ? 一种带电分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度、电泳分子本身所携带的净电荷数、分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关系 。 在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 大分子量的DNA 移动的慢 小分子量的DNA 移动的快 电泳缓冲液 阳极 阴极 DNA加样孔 二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2－50kb之间 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000－1 000 0.7%琼脂糖 20 000－1 000 1.4%琼脂糖 6 000－300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000－100 10.0%聚丙烯酰胺 500－25 20.0%聚丙烯酰胺 50－1 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 ２、核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 二甲苯青：水溶液呈兰色 上样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②使样品呈色，使加样操作更方便 ③在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可观察核酸电泳的情况 ３、核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂：溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 致癌性 在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EB）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微