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凝胶迁移或电泳迁移率试验（EMSA）能够：（1）研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列相互作用。

试验方法原理

凝胶迁移或电泳迁移率试验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一个研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，现在已用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列相互作用。

通常将纯化蛋白和细胞粗提液和32P同位素标识DNA或RNA探针一同保温，在非变性聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合探针移动得慢。同位素标识探针依研究结合蛋白不一样，可是双链或是单链。当检测如转录调控因子一类DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目标RNA结合蛋白位置，可用纯化或部分纯化蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争试验中采取含蛋白结合序列DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白特异性。在竞争特异和非特异片段存在下，依据复合物特点和强度来确定特异结合。

试剂、试剂盒

[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-FreeWaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED（四甲基乙二胺）EMSAGel-Shift结合缓冲液溴酚蓝

仪器、耗材

水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽

试验步骤

一、探针标识

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1.?以下设置探针标识反应体系：

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（1）待标识探针(1.75pmol/微升)：2微升。

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（2）T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)：1微升。

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（3）Nuclease-FreeWater：5微升。

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（4）[γ-32P]ATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml)：1微升。

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（5）T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)：1微升。

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（6）总体积10微升

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（7）根据上述反应体系依次加入多种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。

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2.?使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

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3.?加入1微升探针标识终止液，混匀，终止探针标识反应。

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4.?再加入89微升TE，混匀。此时能够取少许探针用于检测标识效率。通常标识效率在30%以上，即总放射性30%以上标记到了探针上。为试验简便起见，通常无须测定探针标识效率。

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5.?标识好探针最好立即使用，最长使用时间通常不宜超出3天。标识好探针能够保留在-20℃。

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二、探针纯化

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通常为试验简便起见，能够无须纯化标识好探针。在有些时候，纯化后探针会改善EMSA电泳结果。如需纯化，能够根据如下步骤操作：

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1.?对于100微升标识好探针，加入1/4体积即25微升5M醋酸铵，再加入2体积即200微升无水乙醇，混匀。

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2.?在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

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3.?在4℃，12000g-16000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

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4.?在4℃，12000g-16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

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5.?加入100微升TE，完全溶解沉淀。标识好探针最好立即使用，最长使用时间通常不宜超出3天。标识好探针能够保留在-20℃。

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三、EMSA胶配制

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1.?准备好倒胶模具。能够使用常规灌制蛋白电泳胶模具，或其它合适模具。最好选择能够灌制较薄胶模具，方便于干胶等后续操作。为得到愈加好结果，能够选择可灌制较大EMSA胶模具。

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2.?根据以下配方配制20毫升4％聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不一样百分比Acr/Bis对结果影响不大)。

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（1）TBEbuffer(10X)：1毫升。

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重蒸水16.2毫升。

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（2）39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)：2毫升。

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（3）80%甘油：625微升。

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（4）10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)：150微升。

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（5）TEMED：10微升

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3.?根据上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并立即加入到制胶模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。假如