第九章基因工程药物.pptVIP

第九章基因工程药物第1页，共28页，星期日，2025年，2月5日1.无性繁殖系的组建1.1人胰岛素工程菌的组建1.2人α2b型干扰素工程菌的组建1.3集落刺激因子工程菌的组建第2页，共28页，星期日，2025年，2月5日(1)胰岛素的结构及其生物合成1.1人胰岛素工程菌的组建第3页，共28页，星期日，2025年，2月5日(2)人胰岛素的生产方法:A.化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。技术可行，但其生产成本奇高。B.化学转型法制人胰岛素猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素。但工艺复杂，产品的价格不菲。C.基因工程法制人胰岛素1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别。第4页，共28页，星期日，2025年，2月5日a.A链和B链分别表达法：第5页，共28页，星期日，2025年，2月5日由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%－20%,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。第6页，共28页，星期日，2025年，2月5日b.人胰岛素A链和B链同时表达法：第7页，共28页，星期日，2025年，2月5日c.人胰岛素原表达法：第8页，共28页，星期日，2025年，2月5日由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上，每克最终产品的成本仅50美元。第9页，共28页，星期日，2025年，2月5日1.2人α2b型干扰素工程菌的组建(1)人α2b型干扰素基因的获得：应用PCR的方法，从人的染色体片段获得。(2)重组表达质粒的特点：具有双SD序列。抗病毒活性高构建过程见书P172图9-2第10页，共28页，星期日，2025年，2月5日1.3集落刺激因子工程菌的组建(1)RT-PCR法制备GM-CSFcDNA从正常人血中分离出单核细胞，提取总RNA；引物设计：引物１：5‘端增加有EcoRⅠ酶切位点，起始密码子，５个组氨酸密码子和凝血酶切位点引物２：5‘端加一个终止密码子和一个BamHⅠ酶切位点PCR扩增产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接，挑选氨苄青酶素抗性转化子，经酶切筛选、鉴定，阳性重组子命名为pGM09．(2)GM-CSF重组表达载体的构建第11页，共28页，星期日，2025年，2月5日(1)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵1)发酵用工程菌种的筛选将保存的菌种接种到LB琼脂平板上，过夜培养。挑取单菌落进行液体培养，取少量经热诱导培养后，用SDS分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子．2)发酵培养基的选用将工程菌接种于４种发酵培养基中进行发酵，比较诱导表达结果及收菌量，选取合适的发酵用培养基．2.基因工程药物的生产2.1基因工程菌的培养与发酵第12页，共28页，星期日，2025年，2月5日3)接种量对发酵的影响以10％或15％接种量较适宜．4)溶解氧水平对发酵的影响5)pH对工程菌生长和表达的影响前期培养着重工程菌的生长：pH6.8-7.4后期培养着重外源蛋白的表达：pH6.0-6.56)热诱导对表达量的影响热诱导表达的工程菌一般在菌体的对数生长期或对数生长后期，在2min内温度突然升高10℃以上。7)高密度对表达量的影响高表达的前提下，适当提高菌体密度。高水平溶解氧(40％)有利于外源蛋白的形成.第13页，共28页，星期日，2025年，2月5日(2)IFN-α2b基因工程菌的培养与发酵工程菌株:SW-IFNα2b/DH5α工程菌的种子培养:将工程菌接种在LB培养基中，30℃振摇培养10h.工程菌的发酵:接入种子培养液至发酵罐中，30℃发酵８h，然后在42℃诱导２h完成发酵。第14页，共28页，星期日，2025年，2月5日2.2基因工程药物的分离纯化(1)影响分离纯化的主要因素产物活性、纯度和杂质产物表达形式和表达水平产物本身的分子特性产物的用途和需求量第15页，共28页，星期日，2025年，2月5日(2)各种表达形式的分离纯化方法包涵体的分离纯化方法A.菌体细胞的收集与破碎：采用物理、化学和酶学三种方法进行破碎B.包涵体的分离、洗涤与溶解