酶联免疫吸附实验操作指南.docxVIP

大家好，我们这节课介绍酶联免疫吸附实验和虎红平板凝集实验。（翻页）

首先我们来讲第一部分，酶联免疫吸附实验。（翻页）

酶联免疫吸附实验简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。（翻页）

接下来我们介绍一下酶联免疫吸附实验的分类及原理，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。有间接法、双抗夹心法、两位点一步法和竞争结合。（翻页）

首先我们来介绍间接ELISA的基本原理，间接法为临床中常用方法，其原理为将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，可用目测或用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。（翻页）

我们接着来介绍双抗夹心法，双抗夹心法是将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。可用目测或用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

第三种方法，双位点一步法的基本原理是在双抗体夹心法测定抗原时，使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。在一步法测定中，应注意钩状效应。钩状效应是指当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（翻页）

最后我们来讲一下竞争法，竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测抗原为例，将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。加底物显色，参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（翻页）

第三节，我们来介绍酶联免疫吸附的操作方法，实验需准备的器械有：酶标仪、烘箱、微量移液器、诊断试剂和吸水纸。（翻页）

基本实验操作可以分成样品、标准品以及试剂准备；加样；孵育；洗板；显色；比色；结果分析这几步。（翻页）

我们现在详细介绍基本操作方法，第一步为洗涤液配制：用蒸馏水或去离子水将洗涤液按1:10稀释，充分混匀即为工作浓度洗涤液。第二步为样品稀释及加样：用样品稀释液将待检清按1:40稀释，在样品孔每孔仅加入已稀释的待检样品100uL。第三步为加对照品：阴性、阳性对照品不用稀释，直接加样。阴性对照2孔，每孔仅加入100uL阴性对照品；阳性对照2孔，每孔仅加入100uL阳性对照品。盖好封板膜，37°C避光反应30分钟。第四步洗板：甩去孔内液体，每孔注满工作浓度洗涤液洗涤3次，每次均需停留1分钟；最后一次甩净，拍干。第五步加酶反应：每孔加酶标结合物50uL，盖好封板膜，37℃避光反应30分钟。甩去孔内液体，如上洗板，拍干。第六步显色反应：按所需用量，临用前取等体积底物液和显色液充分混匀，每孔加100uL，盖好封板膜，37℃避光反应10分钟。第七步终止反应：加终止液50uL，用酶标仪于450nm波长，读取OD值。（翻页）

第四节，我们来简单讲一下结果的判定，以猪瘟病毒为例。Cut-of值=阴性对照平均OD值×2.1；判定结果之前，首先要进行有效性判定:

阴性对照孔OD值0.20(若大于0.20则实验无效);

阳性对照孔OD值0.50(若小于0.50则实验无效)

检验结果的样品OD值COV，则判为猪瘟病毒抗体阳性;如果样品OD值COV，则判为猪瘟病毒抗体阴性（翻页）

第五节，我们介绍ELISA的注意事项。ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：试剂盒从冷藏环境中取出时，必须平衡至室温后，方可开封启用。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板