T_ZNZ 287-2024 瓜菜作物中抗生素抗性基因检测 高通量荧光定量PCR 法.docxVIP

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T/ZNZ

浙江省农产品质量安全学会团体标准T/ZNZ287—2024

瓜菜作物中抗生素抗性基因检测高通量

荧光定量PCR法

High-throughputquantitativePCRmethodfordetectionofantibiotic

resistancegenesingourdandvegetablecrops

2024-08-28发布2024-09-28实施

浙江省农产品质量安全学会发布

I

T/ZNZ287—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规则起草。

请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。

本文件起草单位：中国科学院城市环境研究所、浙江大学、北京农业生物技术研究中心。

本文件主要起草人：苏建强、安新丽、周昕原、何艳、王旭明。

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瓜菜作物中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR法

1范围

本文件规定了瓜菜作物中抗生素抗性基因的高通量荧光定量PCR测定方法。

本文件适用于瓜果和蔬菜中抗生素抗性基因的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则指标参数

GB/T40170质粒抽提及检测通则抽提方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

抗生素抗性基因antibioticresistancegenes

使细菌对抗生素产生抗性的基因。

3.2

高通量荧光定量PCRhigh-throughputquantitativepolymerasechainreaction，HT-qPCR基于微孔芯片进行高通量、纳升级别的实时定量PCR方法。

3.3

可移动遗传元件mobilegeneticelements

在基因组中可扩散或转移的遗传元件，如质粒、噬菌体、整合子、插入序列和整合接合元件等。3.4

Ct值cyclethreshold

每个反应体系中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.5

基因拷贝数genecopynumber

某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组中出现的数目。

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4原理

采用纳升级多样品自动加样器将样品分配到微孔芯片上，并通过高通量荧光定量PCR仪收集荧光信号，根据获得的Ct值进行定量。

5主要设备和仪器

5.1高通量荧光定量PCR仪

5.2冷冻离心机

5.3涡旋仪

5.4核酸定量仪

5.5多样品纳升分配器

5.6荧光成像系统

6主要试剂和材料

6.1高通量荧光定量芯片

6.2384方孔板

6.3封板膜

6.4平底96孔板

6.5SYBRGreenIMaster

6.6牛血清白蛋白溶液：50mg/mL

6.7超纯水

6.8加样槽

6.9无菌磷酸缓冲液

6.10抗生素抗性基因引物

6.11次氯酸钠溶液：有效氯终浓度0.2%

6.12TE缓冲液：pH8.0

6.13双链DNA超敏检测试剂盒

6.14DNA纯化试剂盒

6.15质粒提取试剂盒

6.16载体连接试剂盒

6.17无菌微孔滤膜0.22μm

7测定步骤

7.1样品采集

绿叶菜类作物样品的采集：选取新鲜成熟的绿叶农作物种类，随机选取5株长势一致的农作物，在同一高度采用无菌剪刀剪取5g叶片放入无菌自封袋中，避光4℃冰箱保存6h内备用。

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茄果类作物样品的采集：选取新鲜成熟的茄果类农作物种类，随机选取3个，采用无菌切刀切取1g放入无菌离心管中，避光4℃冰箱保存6h内备用。

7.2DNA制备

将叶片样品剪碎后置于250mL三角瓶中，加入100mL无菌磷酸缓冲液，超声5min；放置于摇床中，室温、180rpm提取1h后，然后用无菌纱布过滤去除样品中植物组织，再用无菌微孔滤膜过滤，收集叶际微生物，用于DNA提取。

果实样品切碎后置于15mL离心管中，加入15mL无菌磷酸缓冲液，超声5min；放置于摇床中