大肠杆菌基因工程优品文档.pptVIP

大肠杆菌基因工程;基因工程课程内容;回顾：基因工程的基本目的是什么？;问题：如何利用基因资源？;基因工程主要宿主系统;主要的蛋白质生产宿主系统;表达载体的基本条件（关键元件）;表达载体的基本条件（关键元件）;典型的原核表达载体;典型的原核表达载体;典型的真核表达载体;第三章大肠杆菌基因工程;四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化;一、大肠杆菌表达系统的优缺点;原核细胞与真核细胞的差别;生长速度惊人的大肠杆菌;遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作;胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善;;二、大肠杆菌系统高效表达原理;大肠杆菌系统表达载体的基本元件;;;;;;启动子保守序列;启动子的筛选;;启动子;P;P;表达载体的基本条件（关键元件）

色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏

*以Novagen公司的pET系统为杰出代表。

代谢使cAMP减少，也能阻

——来自T7噬菌体的异源启动子

IPTG诱导T7RNA聚合酶表达

系统优化中级

野生型的Plac与其控制区Olac

2）翻译水平

TAATGT

*是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能转录）。

常使Ptrp控制的CI

存在时，整个操纵子处于基

野生型的Plac与其控制区Olac

真核：5’-端非翻译区（5’-UTR）;P;;Plac;;;启动子;受lacI阻遏蛋白调控;;发酵罐中大规模升温困难

如何解决？;T7启动子

——来自T7噬菌体的异源启动子;T7启动子——最成功的启动子;T7启动子调控模式;T7启动子调控模式;策略：较低拷贝质粒（几个至数十个）

细胞周质内含有种类繁多的内毒素

色氨酸是困难的，因此基因工程

用受溶氧浓度控制的启动子调控T7RNA聚合酶合成，以适合工业化发酵的条件控制。

cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达

IPTG：异丙基D-硫代半乳糖苷

转录受CAP正调控和lacI负调控

防止转录过头策略

克隆到启动子探针质粒pKO1上

存在时，整个操纵子处于基

T7噬菌体DNA上的Tf

*可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解;T7启动子调控模式;2、终止子;防止转录过头策略;终止子;3、核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;核糖体结合位点;4、质粒拷贝数;质粒拷贝数;5、密码子;密码子;密码子;思考题（1.大肠杆菌表达系统高效表达原理）;感谢观看