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分子生物学实验操作指导

分子生物学实验是探索生命本质、解析遗传信息的强大工具。其操作的精密性、结果的准确性直接关系到研究结论的可靠性。本指导旨在为分子生物学实验操作者提供一套系统性的操作原则、核心技术要点及注意事项，以期规范操作流程，提高实验成功率，并确保实验安全。

一、实验准备与安全

实验的成功始于充分的准备和对安全的极致重视。这不仅是对实验结果负责，更是对操作者自身和实验环境负责。

1.1实验设计与方案论证

在动手之前，务必对实验目的、原理、预期结果及可能的影响因素进行充分的论证。查阅相关文献，选择成熟可靠的实验方法。对于关键步骤，应预设对照实验（如阳性对照、阴性对照、空白对照）以确保结果的特异性和可靠性。明确实验所需的试剂、耗材、仪器，并检查其可用性与有效期。

1.2实验记录的规范

养成即时、准确、完整记录实验数据的习惯。实验记录应包含日期、实验名称、操作人、实验材料（来源、批号）、试剂（厂家、批号、浓度）、仪器型号、详细操作步骤、观察到的现象、原始数据、图谱照片以及初步分析与讨论。记录应清晰可辨，避免涂改，如有错误，应划改并签名。

1.3个人防护与实验环境

进入实验室必须穿着实验服，根据实验需要佩戴防护眼镜、一次性手套。长发需束起，不佩戴首饰。操作挥发性、腐蚀性或有毒试剂时，应在通风橱内进行。保持实验台面整洁有序，实验区域禁止饮食、饮水及存放个人物品。

1.4试剂与耗材的准备

试剂检查：使用前仔细核对试剂名称、浓度、批号及有效期，观察试剂是否有浑浊、沉淀、变色等异常现象。对需要特殊储存条件（如-20℃、-80℃、避光、干燥）的试剂，使用后应及时归位。

耗材准备：根据实验需求选择合适的耗材，如离心管（规格、材质是否耐高速离心）、吸头（是否带滤芯、是否无菌）、培养皿等。一次性耗材开封前检查包装是否完好无菌。玻璃器皿需洁净、无划痕，必要时需灭菌处理。

1.5仪器的检查与预热

实验前检查所用仪器是否处于正常工作状态，如离心机的转子是否完好、平衡是否正常；PCR仪的温度准确性；移液器的校准状态。对于需要预热的仪器（如金属浴、水浴锅、分光光度计），应提前开启预热，确保达到设定温度后再进行实验。

二、核心实验操作技术

2.1核酸提取技术

核酸（DNA/RNA）的提取是分子生物学实验的基础，其质量直接影响后续的PCR、测序、杂交等实验。

*基本原则：保证核酸一级结构的完整性；排除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子的污染；去除其他核酸分子的干扰（如提取DNA时去除RNA，或反之）；尽量减少化学物质（如有机溶剂、盐离子）的残留。

*操作要点：

*样本处理：新鲜样本应尽快处理，若需保存，应根据样本类型选择合适的保存方式（如-80℃冻存、乙醇固定、特定保存液）。组织样本需充分研磨或匀浆，以释放核酸。

*裂解：根据核酸类型和样本特性选择合适的裂解液（如含SDS的裂解液、胍盐裂解液）。裂解过程应充分，但避免过度物理剪切导致核酸断裂（尤其对基因组DNA）。

*分离纯化：常用方法包括酚-氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法等。离心柱法因其操作简便、纯度高而广泛应用。操作时应严格按照试剂盒说明书进行，注意离心速度和时间的控制。洗涤步骤至关重要，需确保杂质被有效去除。

*沉淀与溶解：乙醇或异丙醇沉淀核酸时，加入适量盐离子（如NaAc、NH4Ac）有助于提高沉淀效率。沉淀后70%乙醇洗涤可有效去除盐分。溶解核酸时，应选择合适的缓冲液（如TE缓冲液、无RNase水），并确保充分溶解。

*RNA提取特别注意事项：RNA极易被RNase降解，实验全程需严格防止RNase污染。操作环境、耗材（离心管、吸头）、试剂均需无RNase。操作人员需佩戴一次性无粉手套，并频繁更换。提取过程中可加入RNase抑制剂。

2.2核酸定量与质量评估

提取的核酸需进行浓度和纯度测定，以确定其是否满足后续实验要求。

*紫外分光光度法：通过测定260nm、280nm、230nm处的吸光度进行评估。

*浓度计算：DNA浓度（ng/μL）=A260×50×稀释倍数；RNA浓度（ng/μL）=A260×40×稀释倍数。

*纯度评估：A260/A280比值：纯DNA约为1.8，纯RNA约为2.0。比值过高或过低提示可能存在蛋白质、酚类或其他杂质污染。A260/A230比值通常应大于2.0，若过低提示可能存在盐离子、有机溶剂等污染。

*琼脂糖凝胶电泳：直观判断核酸的完整性和大致浓度。

*DNA：基因组DNA应呈现一条清晰的高分子量条带，无明显拖尾；质粒DNA通常呈现超螺旋、开环、线性三种构型的条带。

*RNA：总RNA电泳应可见28SrRNA、18SrRNA（真核生物）两条清晰主带，且28S亮度