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血红蛋白实验详细操作流程

一、实验目的与意义

血红蛋白测定是临床常用的血液检验项目之一，其主要目的在于评估个体的贫血状况、红细胞携氧能力，以及作为某些血液系统疾病、慢性疾病或生理状态（如妊娠）的辅助诊断和疗效观察指标。准确测定血红蛋白浓度，对于判断疾病严重程度、指导治疗方案制定及监测预后具有重要的临床价值。

二、实验原理

目前临床实验室中最常用的血红蛋白测定方法为氰化高铁血红蛋白法。其原理是血液经稀释液稀释并溶血后，红细胞内的血红蛋白释放出来，与稀释液中的高铁氰化钾反应，生成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白再与稀释液中的氰化钾结合，形成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白。该化合物在特定波长（通常为540nm）下具有最大吸收峰，通过分光光度计测定其吸光度，并与经过标定的标准液进行比较，即可计算出血红蛋白的浓度。此方法具有操作简便、结果稳定、准确性高、重复性好等优点，被国际血液学标准化委员会推荐为血红蛋白测定的参考方法。

三、实验准备

（一）试剂准备

1.氰化高铁血红蛋白稀释液：市售商品化试剂或按标准配方自行配制。该稀释液通常含有氰化钾、高铁氰化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等成分，具有溶血、转化血红蛋白为氰化高铁血红蛋白及稳定pH值的作用。使用前需确认试剂在有效期内，外观无浑浊、沉淀或变色。

2.标准液：使用经国家计量部门认证的氰化高铁血红蛋白标准液，用于校准分光光度计。

3.质控品：选用合适浓度水平的全血质控品，用于监控实验全过程的质量。

（二）仪器准备

1.分光光度计：应能在540nm波长处进行吸光度测定。使用前需开机预热，确保仪器稳定。按照仪器操作规程进行校准，先用稀释液作为空白调零，再用标准液进行校准，确保吸光度读数准确。

2.微量吸管：用于准确吸取血液样本。常用规格为特定容积的一次性微量吸管，使用前需检查包装是否完好，有无破损或污染。

3.试管：用于盛装稀释后的血液样本，应清洁、干燥，规格适宜。

4.混匀装置：如旋涡混匀器或手工颠倒混匀用的试管架。

5.计时器：用于控制反应时间。

6.移液枪及配套吸头：用于准确移取试剂和样本，不同规格的移液枪应配备相应的吸头，吸头为一次性使用。

（三）标本准备

1.标本类型：通常采用静脉血或毛细血管血。静脉血采集时，使用EDTA-K?或EDTA-K?作为抗凝剂，采集后轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡导致红细胞破坏。毛细血管血采集则需严格按照皮肤采血标准操作流程进行，确保样本无污染、无组织液混入。

2.标本采集与处理：采血过程应规范，避免溶血。采集后的血液标本应尽快送检，若不能及时检测，需在适宜条件下保存，但保存时间不宜过长，具体保存条件和时限参照实验室标准操作程序。

3.标本外观检查：接收标本后，应观察标本有无溶血、脂血、黄疸等情况，这些因素可能会对测定结果产生干扰，必要时需记录并采取相应的处理措施或备注说明。

四、详细操作步骤

（一）样本稀释

1.取一支洁净的试管，做好标记。

2.使用移液枪准确吸取一定量的氰化高铁血红蛋白稀释液加入试管中。具体加入量需根据所用微量吸管的容积和稀释倍数确定，例如，若使用特定容积的微量吸管，则加入对应倍数体积的稀释液。

3.轻轻摇匀试管中的稀释液。

（二）采血与加样

1.若为毛细血管采血，需先对采血部位（通常为无名指指尖内侧）进行严格消毒，待酒精挥发干后，用一次性采血针快速刺入皮肤，深度适中，弃去第一滴血液，然后用微量吸管准确吸取一定量的血液。

2.若为静脉血，则需将抗凝血充分混匀后，用微量吸管准确吸取一定量的血液。

3.迅速将微量吸管内的血液全部加入到已盛有稀释液的试管底部，注意避免吸管尖端接触试管壁，以防血液黏附损失。

（三）混匀与溶血

1.立即用试管帽盖紧试管（或用洁净的手指按住试管口），将试管轻轻颠倒混匀数次，使血液与稀释液充分混合并发生溶血。避免剧烈震荡产生泡沫，影响后续比色。

2.将混合均匀的稀释血液样本置于室温下避光静置一定时间（通常为几分钟），使血红蛋白充分转化为氰化高铁血红蛋白。

（四）比色测定

1.开启分光光度计，预热并调节至所需波长（540nm）。

2.用另一支试管盛装与测定管相同量的稀释液作为空白对照，将其放入比色皿槽中，调节分光光度计的吸光度读数为零。

3.将处理好的样本试管中的液体倒入比色皿中，注意避免产生气泡，若有气泡可用滤纸边缘轻轻吸去。

4.将盛有样本的比色皿放入分光光度计的比色皿槽内，确保光路对准比色皿的透光面。

5.读取并记录分光光度计显示的吸光度值。

（五）标准曲线法或直接计算法

1.标准曲线法：若使用标准曲线法定量，需在测定样本的同时，测定一系列不同浓度的氰化高铁血红蛋白标准液的吸光度，以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲