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CRISPRCas9系统在番茄多基因突变体构建中的应用探究
目录
内容概览．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
1.1研究背景与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7
1.1.1植物基因编辑技术发展概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8
1.1.2番茄遗传育种的现状与挑战．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
1.1.3CRISPR/Cas9技术的崛起与应用前景．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14
1.2国内外研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17
1.2.1CRISPR/Cas9技术在植物中的应用现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．20
1.2.2番茄基因编辑研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21
1.2.3多基因同时编辑技术研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22
1.3研究内容与目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26
1.3.1研究内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27
1.3.2研究目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28
CRISPR/Cas9基因编辑技术原理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31
2.1CRISPR/Cas9系统的组成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32
2.2CRISPR/Cas9基因编辑机制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．35
2.2.1gRNA介导的靶向识别．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38
2.2.2Cas9核酸酶的DNA切割．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．40
2.2.3DNA修复途径与突变产生．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．44
2.3CRISPR/Cas9系统的优化策略．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．48
2.3.1gRNA设计与优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50
2.3.2Cas9表达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52
2.3.3基因编辑效率的提升方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55
番茄多基因突变体构建方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．58
3.1番茄遗传转化方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．60
3.1.1农杆菌介导转化法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63
3.1.2基因枪转化法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．67
3.1.3其他转化方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．69
3.2番茄多基因编辑载体构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．71
3.2.1载体选择与构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．72
3.2.2多gRNA表达盒的设计与融合．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．75
3.2.3载体验证与优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．77
3.3番茄多基因突变体筛选方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．78
3.3.1表型筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82
3.3.2分子水平鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．84
3.3.3融合多种筛选方法的策略．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．87
CRISPR/Cas9系统在番茄多基因突变体构建中的应用实例．．．．．90
4.1CRISPR/Cas9系统在番茄抗病性改良中的应用．．．．．．．．．．．．．．92
4.1.1番茄抗病相关基因的鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．
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